Contusie ruggenmergletsel via een microchirurgische laminectomie in de regeneratieve axolotl
Summary
Dit manuscript presenteert protocollen voor het chirurgisch toebrengen van gecontroleerde bot en scherpe ruggenmergletsels aan een regeneratieve Axolotl (Ambystoma mexicanum).
Abstract
Het doel van deze studie is het vaststellen van een gestandaardiseerd en reproduceerbaar regeneratief botte ruggenmergletsel model in de axolotl (Ambystoma mexicanum). De meeste klinische ruggenmergletsels optreden als hoge energie botte trauma’s, inducerende contusie verwondingen. Echter, de meeste studies in het ruggenmerg van Axolotl zijn uitgevoerd met scherpe trauma’s. Vandaar dat deze studie bedoeld is om een meer klinisch relevant regeneratief model te produceren. Vanwege hun indrukwekkende vermogen om bijna elk weefsel te regenereren, worden Axolotls veel gebruikt als modellen in regeneratieve studies en zijn ze intensief gebruikt in ruggenmergletsel (SCI) studies. In dit protocol wordt de Axolotls verdoiliseerd door onderdompeling in een benzocaïne oplossing. Onder de Microscoop wordt een hoekige incisie bilateraal gemaakt op een niveau dat net caudal is voor de achterpoten. Vanuit deze incisie is het mogelijk om de spineuze processen te ontleden en bloot te leggen. Met behulp van een tang en een schaar wordt een laminectomie op twee niveaus uitgevoerd, waardoor het ruggenmerg wordt blootgesteld. Een aangepaste trauma-apparaat bestaande uit een vallende staaf in een cilinder is geconstrueerd, en dit apparaat wordt gebruikt voor het induceren van een contusie letsel aan het ruggenmerg. De incisies worden vervolgens gehecht, en het dier herstelt van anesthesie. De chirurgische aanpak is succesvol in het blootstellen van het ruggenmerg. Het trauma mechanisme kan contusie verwondingen veroorzaken aan het ruggenmerg, zoals bevestigd door histologie, MRI en neurologisch onderzoek. Ten slotte regenereert het ruggenmerg van het letsel. De kritieke stap van het protocol is het verwijderen van de stekelige processen zonder schade aan het ruggenmerg. Deze stap vereist opleiding om een veilige procedure te waarborgen. Bovendien is wondsluiting sterk afhankelijk van het niet toebrengen van onnodige schade aan de huid tijdens incisie. Het protocol werd uitgevoerd in een gerandomiseerde studie van 12 dieren.
Introduction
Het algemene doel van deze studie was het vaststellen van een gecontroleerde en reproduceerbare microchirurgische methode voor het toebrengen van bot en scherp SCI aan de axolotl (Ambystoma mexicanum), het produceren van een regeneratief ruggenmergletsel model.
SCI is een ernstige aandoening die, afhankelijk van het niveau en de omvang, neurologische handicaps aan de extremiteiten veroorzaakt, samen met een verminderde blaas-en darm controle1,2,3. De meeste Sci zijn het resultaat van High Energy Blunt trauma zoals verkeersongevallen en vallen4,5. Scherpe verwondingen zijn zeer zeldzaam. Daarom is het meest voorkomende macroscopische letsel type contusies.
Het centrale zenuwstelsel van zoogdieren (CNS) is een niet-regeneratief weefsel, vandaar dat er geen herstel van neurologische weefsels na Sci wordt gezien6,7,8. Aan de andere kant, sommige dieren hebben een intrigerende vermogen om te regenereren weefsels, met inbegrip van CNS weefsel. Een van deze dieren is de axolotl. Het wordt veel gebruikt in studies van regeneratieve biologie en is van belang in het ruggenmerg regeneratie, omdat het een gewervelde9,10,11,12.
De meeste Sci-onderzoeken in de axolotl worden uitgevoerd als amputatie van de gehele staart of ablatie van een groter deel van het ruggenmerg9,10,11,12. Onlangs werd een nieuwe studie gepubliceerd over Blunt blessures13 die klinische situaties beter nabootst. Terwijl complete amputatie van het aanhangsel in de axolotl resulteert in volledige regeneratie, zijn sommige niet-amputatie-gebaseerde regeneratieve verschijnselen afhankelijk van het kritische grootte defect (CSD)14,15. Dit betekent dat verwondingen die een kritische drempel overschrijden niet worden geregenereerd. Om een regeneratief model met een hogere klinische translationele waarde te ontwikkelen, onderzocht deze studie of een botte trauma van 2 mm de CSD-limiet zou overschrijden.
Deze methode is relevant voor onderzoekers die werken aan ruggenmerg regeneratie in kleine diermodellen, vooral in de axolotl. Bovendien kan het van meer algemeen belang zijn, omdat het een manier vertoont om standaard laboratoriumapparatuur te gebruiken om een stompe trauma mechanisme te ontwikkelen dat geschikt is voor gebruik bij kleine dieren in het algemeen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Omdat het risico op letsel aan het ruggenmerg significant is, verwijderen de kritische stappen van het protocol de spineuze processen en verbreding van de benige toegang tot het Ruggenmergkanaal indien nodig. Zoals vermeld in het Protocol, het verwijderen van de meest craniale proces eerst wordt sterk aanbevolen. Dit zal betekenen dat de meer caudale processen het ruggenmerg beschermen tegen het raken van de schaar. Het wordt aanbevolen om te zorgen voor voldoende chirurgische toegang, wat betekent dat niet te klein een …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Michael Pedersen, Universiteit van Aarhus voor zijn expertise en tijd bij het ontwikkelen van MRI-protocollen en het opzetten van het hele project. Peter Agger, Universiteit van Aarhus voor zijn expertise en tijd bij het ontwikkelen van de MRI-protocollen. Steffen ring Gard, Universiteit van Aarhus voor zijn expertise en tijd bij het ontwikkelen van de MRI-protocollen. De ontwikkeling van het SCI-model in de axolotl werd vriendelijk ondersteund door de A.P. Møller Maersk Foundation, de Riisfort Foundation, de linex Foundation en de ELRO Foundation.
Materials
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g – 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| kimwipes | |||
| microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
- Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).
- Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. Bladder management and quality of life after spinal cord injury. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).
- Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population. Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).
- Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study. Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).
- Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).
- Aguayo, A. J., et al. Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).
- Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum. Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).
- Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. Regeneration of long spinal axons in the rat. Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).
- Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).
- Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat. Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).
- Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl. Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).
- McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres. Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).
- Thygesen, M. M., et al. A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail. Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).
- Goss, R. J. . Principles of Regeneration. , (1969).
- Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing. Bone. 40 (1), 45-56 (2007).
- Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
