החבלה פגיעה בחוט השדרה באמצעות כריתת למינציה מיקרוכירורגית ב הרגנרציה הנרטיבית
Summary
כתב יד זה מציג פרוטוקולים לגרימת כירורגית מבוקרת פציעות בחוט השדרה החדה בצורה בוטה התחדשות משובי (Ambystoma מקסינום).
Abstract
מטרת מחקר זה היא להקים מודל משובי התחדשות מתוקננת בחוט השדרה בוטה בתוך האקסון (אמייסטומה מקסינום). רוב הפציעות הקליניות בעמוד השדרה מתרחשות בתור טראומות אנרגיה מאוד גבוהות, ומגרימת פציעות חבלה. עם זאת, רוב המחקרים בחוט השדרה האקאואלי נערכו עם טראומות חדות. מכאן, מחקר זה נועד לייצר מודל משובי קלינית יותר רלוונטי. בשל היכולת המרשימה שלהם להתחדש כמעט כל רקמה, axo, משמשים באופן נרחב כמודלים במחקרים רגנרטיבית, שימשו בהרחבה במהלך פגיעה בחוט השדרה (SCI) לימודי. בפרוטוקול זה, האקנויום מורדם באמצעות שאיפה בתמיסה של בנזוקיין. תחת המיקרוסקופ, חתך זוויתי נעשה בקיעים ברמה רק caudal אל הגפיים האחוריות. מחתך זה ניתן לנתח ולחשוף את התהליכים הספיציתיים. באמצעות מלקחיים ומספריים, כריתת למינציה דו-הרמה מבוצעת, חשיפת חוט השדרה. מכשיר טראומה מותאם אישית המורכב מוט נופל בצילינדר נבנה, והמכשיר הזה משמש כדי לגרום לפציעה החבלה בחוט השדרה. ואז החיה מתאוששת מהרדמה. הגישה הכירורגית מצליחה לחשוף את חוט השדרה. מנגנון הטראומה יכול ליצור פציעות חבלה לחוט השדרה, כפי שאושר על ידי היסטולוגיה, MRI, ובדיקה נוירולוגית. לבסוף, חוט השדרה מחדש מן הפציעה. השלב הקריטי של הפרוטוקול מסיר את התהליכים הספיציתיים מבלי לגרום נזק לחוט השדרה. שלב זה דורש הכשרה כדי להבטיח הליך בטוח. יתרה מזאת, סגירת הפצע תלויה מאוד בגרימת נזק מיותר לעור במהלך החיתוך. הפרוטוקול בוצע במחקר אקראי של 12 בעלי חיים.
Introduction
המטרה הכוללת של מחקר זה היה להקים שיטה מיקרוכירורגית מבוקרת ולאחר לגרימת SCI בוטה חדה לבין axoלוטאני (Ambystoma מקסינום), הפקת מודל פגיעה בחוט השדרה התחדשות.
SCI הוא מצב חמור, כי, בהתאם לרמה ובמידה, גורם נכות נוירולוגית לגפיים יחד עם שלפוחית השתן לקויה בקרת מעיים1,2,3. המדע הבדיוני ביותר הם תוצאה של טראומה בוטה באנרגיה גבוהה כגון תאונות דרכים, נופל4,5. . פציעות חדות הן מאוד נדירות לפיכך, סוג הפציעה המקסקופי השכיח ביותר הוא חבורות.
מערכת העצבים המרכזית של היונקים (cn) היא רקמה לא משובי, ולכן אין שחזור של רקמות נוירולוגיות לאחר SCI הוא ראה6,7,8. מצד שני, בעלי חיים מסוימים הם בעלי יכולת מרתקת לחדש רקמות, כולל רקמת ה-CN. . אחת מהחיות הללו היא האקאוסול הוא משמש רבות למחקרים של ביולוגיה רגנרטיבית והוא מתעניין התחדשות חוט השדרה, כי הוא בעלי חוליות9,10,11,12.
רוב לימודי המדע באקסון מבוצעים כקטיעה של הזנב כולו או אבלציה של חלק גדול יותר של חוט השדרה9,10,11,12. לאחרונה, מחקר חדש התפרסם על פציעות קהה13 כי לאחר מחקה מצבים קליניים טוב יותר. הואיל והשלמת התוספת כריתה בתוצאות axol התחדשות מלאה, כמה תופעות משובי שאינן מבוססות קטיעה תלויות פגם בגודל קריטי (csd)14,15. משמעות הדבר היא שפציעות החורגות מסף קריטי אינן נוצרות מחדש. כדי לפתח מודל משובי עם ערך מעבר קליני גבוה יותר, מחקר זה חקר אם טראומה בוטה 2 מ”מ יעלה על הגבול CSD.
שיטה זו רלוונטית עבור חוקרים העובדים על התחדשות חוט השדרה במודלים של בעלי חיים קטנים, במיוחד בצורת axol. יתר על כן, זה עשוי להיות עניין כללי יותר, כי הוא מציג דרך להשתמש בציוד מעבדה סטנדרטיים כדי לפתח מנגנון טראומה קהה המתאים לשימוש בחיות קטנות בכלל.
Protocol
Representative Results
Discussion
מכיוון שהסיכון לפגיעה בחוט השדרה משמעותי, הצעדים הקריטיים של הפרוטוקול מסירים את התהליכים הספיציתיים ואת הרחבת הגישה הגרמית לתעלת השדרה במידת הצורך. כפי שהוזכר בפרוטוקול, הסרת התהליך הגולגולתית ביותר הראשונה מומלצת מאוד. זה אומר כי תהליכים caudal יותר להגן על חוט השדרה מפני פגיעה על ידי המס…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מיכאל פדרסן, אוניברסיטת אורהוס, לצורך התמחותו והזמן בפיתוח פרוטוקולי MRI והקמת הפרויקט כולו. פיטר אגגר, אוניברסיטת ארהוס, מתמחה בפיתוח פרוטוקולי MRI. שטייר רינגגארד, אוניברסיטת אורהוס, לצורך התמחותו והזמן בפיתוח פרוטוקולי ה-MRI. התפתחות המודל הבדיוני באקסון הייתה נתמכת באדיבות קרן מייולר מארסק, קרן רימספורט, קרן Linex וקרן אלרו.
Materials
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g – 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| kimwipes | |||
| microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
- Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).
- Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. Bladder management and quality of life after spinal cord injury. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).
- Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population. Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).
- Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study. Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).
- Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).
- Aguayo, A. J., et al. Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).
- Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum. Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).
- Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. Regeneration of long spinal axons in the rat. Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).
- Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).
- Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat. Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).
- Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl. Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).
- McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres. Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).
- Thygesen, M. M., et al. A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail. Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).
- Goss, R. J. . Principles of Regeneration. , (1969).
- Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing. Bone. 40 (1), 45-56 (2007).
- Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
