Kontusion Rückenmarksverletzung über eine mikrochirurgische Laminektomie im Regenerativen Axolotl
Summary
Dieses Manuskript enthält Protokolle zur chirurgischen Zufügung kontrollierter stumpfer und scharfer Rückenmarksverletzungen zu einem regenerativen Axolotl (Ambystoma mexicanum).
Abstract
Der Zweck dieser Studie ist es, ein standardisiertes und reproduzierbares regeneratives stumpfes Rückenmarksverletzungsmodell im Axolotl (Ambystoma mexicanum) zu etablieren. Die meisten klinischen Rückenmarksverletzungen treten als hochenergetische stumpfe Traumata auf, die Prellungen verursachen. Jedoch, die meisten Studien in der Axolotl Rückenmark wurden mit scharfen Traumata durchgeführt. Daher zielt diese Studie darauf ab, ein klinisch relevanteres regeneratives Modell zu erstellen. Aufgrund ihrer beeindruckenden Fähigkeit, fast jedes Gewebe zu regenerieren, werden Axolotle häufig als Modelle in regenerativen Studien verwendet und wurden ausgiebig in Rückenmarksverletzungen (SCI) Verwendet. In diesem Protokoll werden die Axolotle durch Untertauchen in eine Benzocainlösung anästhetiert. Unter dem Mikroskop wird ein Winkelschnitt bilateral auf einer Ebene gemacht, die nur kaudal zu den Hinterbeinen ist. Aus diesem Schnitt ist es möglich, die spinösen Prozesse zu sezieren und zu entlarven. Mit Zangen und Schere wird eine zweistufige Laminektomie durchgeführt, die das Rückenmark freilegt. Ein benutzerdefiniertes Traumagerät, das aus einer fallenden Stange in einem Zylinder besteht, ist konstruiert, und dieses Gerät wird verwendet, um eine Prellungsverletzung des Rückenmarks zu induzieren. Die Schnitte werden dann vernässt, und das Tier erholt sich von der Anästhesie. Der chirurgische Ansatz ist erfolgreich bei der Exposition des Rückenmarks. Der Traumamechanismus kann Prellungen am Rückenmark hervorrufen, wie durch Histologie, MRT und neurologische Untersuchung bestätigt wird. Schließlich regeneriert sich das Rückenmark von der Verletzung. Der entscheidende Schritt des Protokolls besteht darin, die spinalen Prozesse zu entfernen, ohne das Rückenmark zu beschädigen. Dieser Schritt erfordert Schulungen, um ein sicheres Verfahren zu gewährleisten. Darüber hinaus ist der Wundverschluss in hohem Maße davon abhängig, dass die Haut beim Einschnitt nicht unnötig beschädigt wird. Das Protokoll wurde in einer randomisierten Studie mit 12 Tieren durchgeführt.
Introduction
Das übergeordnete Ziel dieser Studie war es, eine kontrollierte und reproduzierbare mikrochirurgische Methode zu etablieren, um dem Axolotl (Ambystoma mexicanum)stumpfes und scharfes SCI zuzufügen, wodurch ein regeneratives Rückenmarksverletzungsmodell produziert wird.
SCI ist eine schwere Erkrankung, die, je nach Niveau und Ausmaß, neurologische Behinderung der Extremitäten zusammen mit beeinträchtigter Blasen- und Darmkontrolle1,2,3verursacht. Die meisten SCI sind das Ergebnis von hochenergetischen stumpfen Traumata wie Verkehrsunfällen und Stürzen4,5. Scharfe Verletzungen sind sehr selten. Daher ist der häufigste makroskopische Verletzungstyp Prellungen.
Das Säugetier-Zentralnervensystem (ZNS) ist ein nicht-regeneratives Gewebe, daher wird keine Wiederherstellung des neurologischen Gewebes nach SCI gesehen6,7,8. Auf der anderen Seite haben einige Tiere eine faszinierende Fähigkeit, Gewebe zu regenerieren, einschließlich ZNS-Gewebe. Eines dieser Tiere ist das Axolotl. Es ist weit verbreitet in Studien der regenerativen Biologie und ist von Interesse in der Rückenmarksregeneration, weil es ein Wirbeltier9,10,11,12ist.
Die meisten SCI-Studien im Axolotl werden entweder als Amputation des gesamten Schwanzes oder als Ablation eines größeren Teils des Rückenmarks9,10,11,12durchgeführt. Kürzlich wurde eine neue Studie über stumpfe Verletzungenveröffentlicht 13, die klinische Situationen besser imitiert. Während eine vollständige Anbelagamputation im Axolotl zu einer vollständigen Regeneration führt, sind einige nicht amputationsbasierte regenerative Phänomene vom kritischen Größenfehler (CSD)14,15abhängig. Dies bedeutet, dass Verletzungen, die einen kritischen Schwellenwert überschreiten, nicht regeneriert werden. Um ein regeneratives Modell mit einem höheren klinischen Translationswert zu entwickeln, untersuchte diese Studie, ob ein 2 mm stumpfes Trauma die CSD-Grenze überschreiten würde.
Diese Methode ist relevant für Forscher, die an der Rückenmarksregeneration in Kleintiermodellen arbeiten, insbesondere im Axolotl. Darüber hinaus kann es von allgemeinem Interesse sein, weil es eine Möglichkeit zeigt, Standard-Laborgeräte zu verwenden, um einen stumpfen Traumamechanismus zu entwickeln, der für den Einsatz bei Kleintieren im Allgemeinen geeignet ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Da das Verletzungsrisiko des Rückenmarks erheblich ist, sind die entscheidenden Schritte des Protokolls die Entfernung der spinalen Prozesse und die Erweiterung des knöchernen Zugangs zum Rückenmarkskanal, falls erforderlich. Wie im Protokoll erwähnt, ist das Entfernen des kranialsten Prozesses zuerst sehr zu empfehlen. Dies bedeutet, dass die kaudalen Prozesse das Rückenmark davor schützen, von der Schere getroffen zu werden. Es wird empfohlen, genügend chirurgischen Zugang zu gewährleisten, was bedeutet, dass n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Michael Pedersen, Universität Aarhus für sein Know-how und Zeit bei der Entwicklung von MRT-Protokollen und der Einrichtung des gesamten Projekts. Peter Agger, Universität Aarhus für seine Expertise und Zeit bei der Entwicklung der MRT-Protokolle. Steffen Ringgard, Universität Aarhus für seine Expertise und Zeit bei der Entwicklung der MRT-Protokolle. Die Entwicklung des SCI-Modells im Axolotl wurde freundlicherweise von der A.P. M. Maersk Foundation, der Riisfort Foundation, der Linex Foundation und der ELRO Foundation unterstützt.
Materials
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g – 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| kimwipes | |||
| microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
- Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).
- Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. Bladder management and quality of life after spinal cord injury. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).
- Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population. Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).
- Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study. Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).
- Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).
- Aguayo, A. J., et al. Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).
- Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum. Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).
- Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. Regeneration of long spinal axons in the rat. Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).
- Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).
- Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat. Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).
- Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl. Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).
- McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres. Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).
- Thygesen, M. M., et al. A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail. Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).
- Goss, R. J. . Principles of Regeneration. , (1969).
- Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing. Bone. 40 (1), 45-56 (2007).
- Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
