재생 액소틀의 미세 외과 적 중수 절제술을 통한 타박상 척수 손상
Summary
이 원고는 외과적으로 제어 된 무딘 날카로운 척수 손상을 재생 성 축술(Ambystoma 멕시코)에가하는 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
이 연구의 목적은 액소로틀(Ambystoma 멕시코)에서표준화되고 재현 가능한 재생 성 무딘 척수 손상 모델을 확립하는 것입니다. 대부분의 임상 척수 손상은 높은 에너지 무딘 외상으로 발생, 타박상 부상을 유도. 그러나, axolotl 척수에 있는 대부분의 연구 결과는 날카로운 외상으로 실시되었습니다. 따라서, 이 연구는 더 임상적으로 관련 있는 재생 모델을 생산 하는 것을 목표로. 거의 모든 조직을 재생하는 인상적인 능력으로 인해 액소로톨은 재생 연구에서 모델로 널리 사용되며 척수 손상 (SCI) 연구에서 광범위하게 사용되었습니다. 이 프로토콜에서, 액소로틀은 벤조카인 용액에 침수시킴으로써 마취된다. 현미경의 밑에, 각 절개는 뒷다리에 다만 꼬리치는 수준에서 양측으로 만들어집니다. 이 절개에서 가소 성 프로세스를 해부하고 노출 할 수 있습니다. 집게와 가위를 사용하여 척수를 노출하는 2 단계 의 라민 절제술이 수행됩니다. 실린더에 떨어지는 막대로 구성된 사용자 정의 외상 장치가 구성되며,이 장치는 척수에 타박상 부상을 유발하는 데 사용됩니다. 절개는 그 때 봉합되고, 동물은 마취에서 복구됩니다. 외과 접근은 척수를 드러내는 에서 성공적입니다. 외상 메커니즘은 조직학, MRI 및 신경 학적 검사에 의해 확인 된 바와 같이 척수에 타박상 부상을 일으킬 수 있습니다. 마지막으로 척수는 부상에서 재생됩니다. 프로토콜의 중요한 단계는 척수에 손상을 입히지 않고 가시 과정을 제거하는 것입니다. 이 단계에서는 안전한 절차를 보장하기 위한 교육이 필요합니다. 또한, 상처 폐쇄는 절개 중에 피부에 불필요한 손상을 입히지 않는 것에 크게 의존합니다. 프로토콜은 12마리의 동물을 무작위로 연구하여 수행되었다.
Introduction
이 연구의 전반적인 목표는 축색에 무딘 날카로운 SCI를 가하기 위한 제어되고 재현 가능한 미세 수술 방법을 확립하는 것이었습니다(Ambystoma 멕시카눔),재생 척수 손상 모델을 생성.
SCI는 수준과 정도에 따라 방광 및 대장 조절장애와함께 사지에 신경 장애를 가하는 심각한 상태이며1,2,3. 대부분의 SCI는 교통사고와 같은 고에너지 무딘 외상의 결과이며4,5. 날카로운 부상은 매우 드뭅니다. 따라서 가장 일반적인 거시적 상해 유형은 타박상입니다.
포유류 중추 신경계(CNS)는 재생되지 않는 조직이므로 SCI에 따른 신경 조직의 복원이없음은 6,7,8. 다른 한편으로는, 몇몇 동물은 CNS 조직을 포함하여 조직을 재생하는 흥미로운 기능이 있습니다. 이 동물 들 중 하나는 축 색으로 틀. 그것은 널리 재생 생물학의 연구에 사용되며 척수 재생에 관심이, 그것은 척추 동물이기 때문에9,10,11,12.
액소로틀에서의 대부분의 SCI 연구는 전체 꼬리의 절단 또는 척수의 큰 부분의 절제로서 수행된다9,10,11,12. 최근, 새로운 연구는 무딘 부상에 발표 되었다13 그 더 나은 임상 상황을 모방. 액소로틀에서완전한 부속절단이 완전한 재생을 초래하는 반면, 일부 비절단기반 재생현상은 임계크기 결손(CSD)14,15에의존한다. 즉, 임계 임계값을 초과하는 부상은 재생되지 않습니다. 더 높은 임상 번역 값을 가진 재생 모델을 개발하기 위하여, 이 연구 결과는 2 mm 무딘 외상이 CSD 한계를 초과할 지 여부를 조사했습니다.
이 방법은 작은 동물 모델에서 척수 재생에 종사하는 연구원, 특히 액소로틀에서 관련이 있습니다. 더욱이, 그것은 일반적인 관심사일 지도 모릅니다, 일반적인 작은 동물에서 사용하기에 적합한 무딘 외상 기계장치를 개발하기 위하여 표준 실험실 장비를 사용하는 쪽을 전시하기 때문에.
Protocol
Representative Results
Discussion
척수 손상의 위험이 중요하기 때문에 프로토콜의 중요한 단계는 가시 과정을 제거하고 필요한 경우 척추 관에 대한 뼈 접근을 넓히는 것입니다. 프로토콜에서 언급했듯이 가장 두개골 프로세스를 먼저 제거하는 것이 좋습니다. 이것은 더 많은 꼬리 프로세스가 척수에 의해 명중되는 것을 보호한다는 것을 의미합니다. 그것은 충분한 수술 접근을 보장하는 것이 좋습니다, 너무 작은 기본 절개를하…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
마이클 페더슨, 오르후스 대학은 MRI 프로토콜을 개발하고 전체 프로젝트를 설정하는 데 대한 전문 지식과 시간을 가지고 있습니다. 피터 아거, MRI 프로토콜 개발에 자신의 전문 지식과 시간에 대한 오르후스 대학. 스테펜 링가드, MRI 프로토콜 개발에 자신의 전문 지식과 시간에 대한 오르후스 대학. 액솔로틀에서 SCI 모델의 개발은 A.P. Møller Maersk 재단, 리스포르트 재단, 라인스 재단, ELRO 재단에 의해 친절하게 지원되었습니다.
Materials
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g – 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| kimwipes | |||
| microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
- Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).
- Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. Bladder management and quality of life after spinal cord injury. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).
- Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population. Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).
- Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study. Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).
- Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).
- Aguayo, A. J., et al. Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).
- Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum. Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).
- Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. Regeneration of long spinal axons in the rat. Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).
- Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).
- Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat. Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).
- Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl. Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).
- McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres. Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).
- Thygesen, M. M., et al. A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail. Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).
- Goss, R. J. . Principles of Regeneration. , (1969).
- Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing. Bone. 40 (1), 45-56 (2007).
- Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
