Ferimento da medula espinal da contusão através de um Laminectomy Microsurgical no Axolotl regenerative

Summary

Este manuscrito apresenta protocolos para infestar cirùrgica ferimentos de medula espinal controlados e afiados a um Axolotl regenerativo (mexicanum de Ambystoma).

Abstract

O objetivo deste estudo é estabelecer um modelo de lesão medular sem corte regenerativa padronizada e reprodutível no Axolotl (Ambystoma mexicanum). A maioria das lesões clínicas da medula espinhal ocorrem como traumas contundentes de alta energia, induzindo lesões de contusão. Entretanto, a maioria de estudos na medula espinal do Axolotl foram conduzidos com traumas afiados. Assim, este estudo tem como objetivo produzir um modelo regenerativo mais clinicamente relevante. Devido à sua impressionante capacidade de regenerar quase todos os tecidos, axolotls são amplamente utilizados como modelos em estudos regenerativos e têm sido amplamente utilizados em estudos de lesão medular (SCI). Neste protocolo, os axolotls são anestesiados por submersão em solução de benzocaína. o microscópio, uma incisão angular é feita bilateralmente em um nível apenas caudal para os membros posteriores. A partir desta incisão, é possível dissecar e expor os processos espinhoso. Usando fórceps e tesouras, um laminectomy de dois níveis é executado, expondo a medula espinal. Um dispositivo feito encomenda do traumatismo que consiste em uma haste de queda em um cilindro é construído, e este dispositivo é usado para induzir um ferimento da contusão à medula espinal. As incisões são então suturadas, e o animal se recupera da anestesia. A aproximação cirúrgica é bem sucedida em expor a medula espinal. O mecanismo do traumatismo pode produzir os ferimentos da contusão à medula espinal, como confirmado pela histologia, pelo MRI, e pelo exame neurológico. Finalmente, a medula espinhal se regenera da lesão. A etapa crítica do protocolo é remover os processos espinhoso sem causar dano à medula espinal. Esta etapa requer treinamento para garantir um procedimento seguro. Além disso, o fechamento da ferida é altamente dependente de não infestar danos desnecessários à pele durante a incisão. O protocolo foi realizado em estudo randomizado de 12 animais.

Introduction

O objetivo geral deste estudo foi estabelecer um método microcirúrgico controlado e reprodutível para infestar o Sci Blunt e afiado ao Axolotl (mexicanum de Ambystoma), produzindo um modelo regenerativa da lesão da medula espinal.

A LM é uma condição grave que, dependendo do nível e da extensão, inflige incapacidade neurológica às extremidades, juntamente com comprometimento da bexiga e do controle intestinal^1,2,3. A maioria de Sci são o resultado do traumatismo sem corte da alta energia tal como acidentes de tráfego e quedas^4,5. Os ferimentos afiados são muito raros. Portanto, o tipo de lesão macroscópica mais comum é contusões.

O sistema nervoso central de mamíferos (SNC) é um tecido não regenerativo,^{portanto, não}é observada restauração do tecido neurológico após a LM^6,7,8. Por outro lado, alguns animais têm uma capacidade intrigante de regenerar os tecidos, incluindo o tecido do SNC. Um desses animais é o Axolotl. É amplamente utilizado em estudos de biologia regenerativa e é de interesse na regeneração da medula^{espinhal, pois}é um vertebrado^9,10,11^,12.

A maioria dos estudos de Sci no Axolotl são realizadas como amputação de toda a cauda ou ablação de uma parte maior da medula espinhal^9,10,11,12. Recentemente, um novo estudo foi publicado em lesões contundentes¹³ que imita situações clínicas melhor. Considerando que a amputação completa do apêndice no Axolotl resulta em regeneração total, alguns fenômenos regenerativos não baseados na amputação dependem do defeito^{crítico de tamanho}(CSD)^14,15. Isto significa que as lesões que excedem um limiar crítico não são regeneradas. Para desenvolver um modelo regenerativo com maior valor translacional clínico, este estudo investigou se um trauma contundente de 2 mm excederia o limite da CSD.

Este método é relevante para pesquisadores que trabalham na regeneração da medula espinhal em pequenos modelos animais, especialmente no Axolotl. Além disso, pode ser de interesse mais geral, porque apresenta uma maneira de usar o equipamento de laboratório padrão para desenvolver um mecanismo sem corte do traumatismo que seja apropriado para o uso em animais pequenos geralmente.

Protocol

Todos os regulamentos institucionais e governamentais aplicáveis ao uso ético dos animais foram seguidos durante este estudo. O estudo foi conduzido o ID de aprovação: 2015-15-0201-0061 pela Inspetoria da experimentação animal dinamarquesa. Os animais foram axolotls mexicanos (Ambystoma mexicanum, massa corporal média ± dst: 12,12 g ± 1,25 g). 1. preparação Prepare o Axolotl para a anestesia. Use água de torneira não-quimicamente trat…

Representative Results

O objetivo do protocolo é produzir uma SCI que irá paralisar as funções motoras e sensoriais caudais à lesão. Porque o Axolotl é regeneração-competente restaura a função dentro das semanas, permitindo que os investigadores estudem a regeneração do CNS durante um intervalo de tempo curto. A anestesia foi fornecida para 45 min a todos os animais, e nenhum episódio de recuperação pré-termo foi experimentado. Todos os animais recuperados dentro de uma hora e não mostraram sinais …

Discussion

Porque o risco de ferimento à medula espinal é significativo, as etapas críticas do protocolo estão removendo os processos espinhoso e o alargamento do acesso ósseo ao canal espinal se necessário. Como mencionado no protocolo, a remoção do processo mais craniano primeiro é altamente recomendável. Isto significará que os processos mais caudais protegem a medula espinal de ser batido pela tesoura. Recomenda-se assegurar o suficiente acesso cirúrgico, significando não fazer demasiado pequeno uma incisão prelim…

Materials

25 g custom falling rod	custom home made
30 mm PVC pipe	custom home made
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1	Propanone
Axolotl (Ambystoma mexicanum)	Exoterra GmbH	N/A	12-22 cm and 10 g – 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP)
Benzocain	Sigma-Aldrich	94-09-7	ethyl 4-aminobenzoate
electromaget	custom home made
Excel 2010	Microsoft	N/A	Excel 2010 or newer
ImageJ	National Institutes of Health		ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
kimwipes
microsurgical instruments	N/A	N/A	Forceps and scissors
MS550s	Fujifilm, Visualsonics	MS550s	40 MHz center frequency, transducer
MS700	Fujifilm, Visualsonics	MS700	50 MHz center frequency, transducer
Petri dish	any maker
Soft cloth	N/A	N/A	Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Stereo microscope
Vevo 2100	Fujifilm, Visualsonics	Vevo 2100	High frequency ultrasound system