Contusion Spinal Cord Injury via a Microsurgical Laminectomy in the Regenerative Axolotl
Summary
Ce manuscrit présente des protocoles pour infliger chirurgicalement des lésions de la moelle épinière émoussées et pointues contrôlées à un axolotl régénérateur (Ambystoma mexicanum).
Abstract
Le but de cette étude est d’établir un modèle normalisé et reproductible de lésions médullaires émoussées régénératrices dans l’axolotl (Ambystoma mexicanum). La plupart des dommages cliniques de moelle épinière se produisent comme traumas émoussés d’énergie élevée, induisant des dommages de contusion. Cependant, la plupart des études dans la moelle épinière axolotl ont été menées avec des traumatismes pointus. Par conséquent, cette étude vise à produire un modèle régénérateur plus pertinent sur le plan clinique. En raison de leur capacité impressionnante à régénérer presque n’importe quel tissu, les axolotls sont largement utilisés comme modèles dans les études régénératives et ont été largement utilisés dans les études sur les lésions de la moelle épinière (SCI). Dans ce protocole, les axolotls sont anesthésiés par submersion dans une solution de benzocaïne. Sous le microscope, une incision angulaire est faite bilatéralement à un niveau juste caudal aux membres postérieurs. De cette incision, il est possible de disséquer et d’exposer les processus spinous. À l’aide de forceps et de ciseaux, une laminctomie à deux niveaux est effectuée, exposant la moelle épinière. Un dispositif de trauma sur mesure composé d’une tige tombante dans un cylindre est construit, et ce dispositif est utilisé pour induire une blessure de contusion à la moelle épinière. Les incisions sont ensuite sutures, et l’animal se remet de l’anesthésie. L’approche chirurgicale réussit à exposer la moelle épinière. Le mécanisme de trauma peut produire des dommages de contusion à la moelle épinière, comme confirmé par l’histologie, L’IRM, et l’examen neurologique. Enfin, la moelle épinière se régénère à partir de la blessure. L’étape critique du protocole est d’enlever les processus de pieux sans infliger des dommages à la moelle épinière. Cette étape nécessite une formation pour assurer une procédure sûre. En outre, la fermeture des plaies dépend fortement de ne pas infliger de dommages inutiles à la peau pendant l’incision. Le protocole a été exécuté dans une étude randomisée de 12 animaux.
Introduction
L’objectif global de cette étude était d’établir une méthode microchirurgicale contrôlée et reproductible pour infliger le SCI émoussé et pointu à l’axolotl (Ambystoma mexicanum), produisant un modèle régénérateur de lésions de la moelle épinière.
SCI est une condition grave qui, selon le niveau et l’étendue, inflige une incapacité neurologique aux extrémités ainsi que la vessie altérée et le contrôle de l’intestin1,2,3. La plupart des SCI sont le résultat de traumatismes émoussés à haute énergie tels que les accidents de la circulation et les chutes4,5. Les blessures graves sont très rares. Par conséquent, le type de blessure macroscopique le plus commun est contusions.
Le système nerveux central des mammifères (SNC) est un tissu non régénérateur, donc aucune restauration de tissu neurologique suivant SCI est vu6,7,8. D’autre part, certains animaux ont une capacité intrigante de régénérer les tissus, y compris les tissus du SNC. L’un de ces animaux est l’axolotl. Il est largement utilisé dans les études de biologie régénérative et est d’intérêt dans la régénération de la moelle épinière, parce qu’il est un vertébré9,10,11,12.
La plupart des études SCI dans l’axolotl sont effectuées soit comme l’amputation de la queue entière ou l’ablation d’une plus grande partie de la moelle épinière9,10,11,12. Récemment, une nouvelle étude a été éditée sur des dommages émoussés13 qui imite mieux des situations cliniques. Alors que l’amputation complète de l’appendice dans l’axolotl entraîne une régénération complète, certains phénomènes régénératifs non basés sur l’amputation dépendent du défaut critique de taille (CSD)14,15. Cela signifie que les blessures dépassant un seuil critique ne sont pas régénérées. Pour développer un modèle régénérateur avec une valeur translationnelle clinique plus élevée, cette étude a étudié si un traumatisme émoussé de 2 mm dépasserait la limite de CSD.
Cette méthode est pertinente pour les chercheurs travaillant sur la régénération de la moelle épinière chez les petits modèles animaux, en particulier dans l’axolotl. En outre, il peut être d’intérêt plus général, car il montre une façon d’utiliser l’équipement de laboratoire standard pour développer un mécanisme de traumatisme contondant qui est approprié pour une utilisation chez les petits animaux en général.
Protocol
Representative Results
Discussion
Puisque le risque de blessure à la moelle épinière est significatif, les étapes critiques du protocole sont enlevant les processus pieux et l’élargissement de l’accès osseux au canal spinal si nécessaire. Comme mentionné dans le protocole, l’élimination du processus le plus crânien d’abord est fortement recommandé. Cela signifie que plus les processus caudaux protègent la moelle épinière contre les ciseaux. Il est recommandé d’assurer un accès chirurgical suffisant, c’est-à-dire de ne pas faire une incis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Michael Pedersen, Université d’Aarhus pour son expertise et son temps sur l’élaboration de protocoles d’IRM et la mise en place de l’ensemble du projet. Peter Agger, Université d’Aarhus pour son expertise et son temps sur l’élaboration des protocoles d’IRM. Steffen Ringgard, Université d’Aarhus pour son expertise et son temps sur l’élaboration des protocoles d’IRM. Le développement du modèle SCI dans l’axolotl a été aimablement soutenu par la Fondation A.P. Meller Maersk, la Fondation Riisfort, la Fondation Linex et la Fondation ELRO.
Materials
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g – 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| kimwipes | |||
| microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
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