Ушиб спинного мозга травма с помощью микрохирургической ламинэктомии в регенеративной аксолотл
Summary
Данная рукопись представляет протоколы для хирургически inflicting контролируемые туповые и острые повреждения спинного мозга к регенеративному аксолоту(Ambystoma mexicanum).
Abstract
Цель этого исследования заключается в создании стандартизированных и воспроизводимых регенеративных тупой спинного мозга травмы модели в аксолотле (Ambystoma mexicanum). Большинство клинических травм спинного мозга происходят как высокая энергия тупые травмы, вызывая ушиб травмы. Тем не менее, большинство исследований в аксолотле спинного мозга были проведены с острыми травмами. Таким образом, это исследование направлено на создание более клинически регенеративной модели. Из-за их впечатляющей способности регенерировать почти любую ткань, аксолотлы широко используются в качестве моделей в регенеративных исследованиях и широко использовались в исследованиях травм спинного мозга (SCI). В этом протоколе аксолотлы обезболиваются путем погружения в раствор бензокаина. Под микроскопом, угловой разрез делается на двусторонней основе на уровне только caudal к задним конечностям. Из этого разреза можно вскрыть и разоблачить спиннородные процессы. Используя щипцы и ножницы, проводится двухуровневая ламинэктомия, обнажая спинной мозг. Изготовлено специальное травматическое устройство, состоящее из падающего стержня в цилиндре, и это устройство используется для индуцирования ушиба спинного мозга. Затем разрезы зашиваются, и животное восстанавливается после наркоза. Хирургический подход успешно в разоблачении спинного мозга. Травматический механизм может привести к ушибу спинного мозга, что подтверждается гистологией, МРТ и неврологическим обследованием. Наконец, спинной мозг регенерирует от травмы. Критическим шагом протокола является удаление спинномозговых процессов без нанесения повреждений спинного мозга. Этот шаг требует обучения для обеспечения безопасной процедуры. Кроме того, закрытие раны в высокой степени зависит от не нанесения ненужного повреждения коже во время разреза. Протокол был выполнен в рандомизированном исследовании 12 животных.
Introduction
Общая цель этого исследования заключается в создании контролируемого и воспроизводимого микрохирургического метода для нанесения тупой и резкий SCI аксолотл (Ambystoma mexicanum), производя регенеративной модели травмы спинного мозга.
SCI является тяжелым состоянием, которое, в зависимости от уровня и степени, наносит неврологическую инвалидность конечностей наряду с нарушениями мочевого пузыря и кишечника управления1,2,3. Большинство SCI являются результатом высокой энергии тупой травмы, такие как дорожно-транспортных происшествий и падает4,5. Острые травмы очень редки. Таким образом, наиболее распространенным макроскопическим типом травмявляется контуция.
Центральная нервная система млекопитающих (ЦНС) является нерегенеративной ткани, следовательно, не восстановление неврологических тканей после SCI видел6,7,8. С другой стороны, некоторые животные обладают интригующей способностью к регенерации тканей, в том числе тканей ЦНС. Одним из таких животных является аксолотль. Он широко используется в исследованиях регенеративной биологии и представляет интерес в регенерации спинного мозга, потому что это позвоночный9,10,11,12.
Большинство исследований SCI в аксолотле выполняются как либо ампутация всего хвоста или абляции большей части спинного мозга9,10,11,12. Недавно было опубликовано новое исследование о тупых травмах13, которое лучше имитирует клинические ситуации. В то время как полная ампутация придатка в аксолле приводит к полной регенерации, некоторые регенеративные явления, не связанные с ампутацией, зависят от дефекта критического размера (CSD)14,15. Это означает, что травмы, превышающие критический порог, не регенерируются. Для разработки регенеративной модели с более высоким клиническим переводческим значением, это исследование исследовало ли 2 мм тупой травмы будет превышать предел CSD.
Этот метод актуален для исследователей, работающих над регенерацией спинного мозга в небольших моделях животных, особенно в аксолотле. Кроме того, он может представлять более общий интерес, поскольку он демонстрирует способ использования стандартного лабораторного оборудования для разработки механизма тупой травмы, который подходит для использования в мелких животных в целом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Поскольку риск повреждения спинного мозга является значительным, критические шаги протокола удаления спинномозговых процессов и расширения костного доступа к спинному каналу, если это необходимо. Как уже упоминалось в протоколе, удаление наиболее черепного процесса в первую очередь…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Майкл Педерсен (Michael Pedersen), Орхусский университет, за его опыт и время разработки протоколов МРТ и создания всего проекта. Питер Аггер (Peter Agger), Орхусский университет, за его опыт и время разработки протоколов МРТ. Штеффен Ринггард (Steffen Ringgard), Орхусский университет за его опыт и время разработки протоколов МРТ. Разработка модели SCI в аксолотле была любезно поддержана Фондом А.П. Мюллера Maersk, Фондом Рийсфорта, Фондом Линекса и Фондом ELRO.
Materials
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g – 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| kimwipes | |||
| microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
- Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).
- Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. Bladder management and quality of life after spinal cord injury. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).
- Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population. Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).
- Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study. Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).
- Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).
- Aguayo, A. J., et al. Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).
- Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum. Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).
- Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. Regeneration of long spinal axons in the rat. Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).
- Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).
- Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat. Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).
- Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl. Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).
- McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres. Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).
- Thygesen, M. M., et al. A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail. Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).
- Goss, R. J. . Principles of Regeneration. , (1969).
- Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing. Bone. 40 (1), 45-56 (2007).
- Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
