अपक्षयी Axolotl में एक Microsurgical Laminectomy के माध्यम से भ्रम स्पाइनल कॉर्ड चोट
Summary
इस पांडुलिपि शल्य चिकित्सा नियंत्रित कुंद और तेज रीढ़ की हड्डी एक पुनर्योजी axolotl(Ambystoma mexicanum) को चोट पहुँचाने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है.
Abstract
इस अध्ययन का उद्देश्य एक्सोटोलट (एम्बीस्टोमा मैक्सिकनम )में एक मानकीकृत और पुन: उत्पादन योग्य कुंद रीढ़ की हड्डी की चोट मॉडल स्थापित करना है। अधिकांश नैदानिक रीढ़ की हड्डी की चोटों उच्च ऊर्जा कुंद आघात के रूप में होते हैं, contusion चोटों को प्रेरित. हालांकि, axolotl रीढ़ की हड्डी में सबसे अधिक अध्ययन तेज आघात के साथ आयोजित किया गया है. इसलिए, इस अध्ययन के लिए एक और अधिक चिकित्सकीय प्रासंगिक पुनर्योजी मॉडल का उत्पादन करना है. लगभग किसी भी ऊतक पुनर्जीवित करने के लिए उनके प्रभावशाली क्षमता के कारण, axolotls व्यापक रूप से पुनर्योजी अध्ययन में मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है और रीढ़ की हड्डी की चोट (SCI) अध्ययन में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. इस प्रोटोकॉल में, एक्सोलोट्स एक बेंजोकेन समाधान में पनडुब्बी द्वारा एनेस्थेटाइज किए जाते हैं। सूक्ष्मदर्शी के अंतर्गत, एक कोणीय चीरा द्विपक्षीय रूप से पिछले अंगों के लिए केवल पुच्छ स्तर पर किया जाता है। इस चीरा से, यह विच्छेदन और spinous प्रक्रियाओं को बेनकाब करने के लिए संभव है. संद-शिलाऔर का उपयोग करना, एक दो स्तरीय लेमिनेक्टॉमी की जाती है, जो रीढ़ की हड्डी को उजागर करती है। एक सिलेंडर में एक गिरने रॉड से मिलकर एक कस्टम आघात डिवाइस का निर्माण किया है, और इस उपकरण रीढ़ की हड्डी के लिए एक भ्रम चोट प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। चीरों तो सीवन कर रहे हैं, और जानवर संज्ञाहरण से ठीक हो. शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण रीढ़ की हड्डी को उजागर करने में सफल होता है। आघात तंत्र रीढ़ की हड्डी के लिए भ्रम चोटों का उत्पादन कर सकते हैं, के रूप में ऊतक विज्ञान, एमआरआई, और तंत्रिका विज्ञान परीक्षा द्वारा की पुष्टि की. अंत में, रीढ़ की हड्डी चोट से पुनर्जीवित करती है। प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण कदम रीढ़ की हड्डी को नुकसान पहुँचाए बिना स्पिनस प्रक्रियाओं को हटा रहा है। इस चरण के लिए एक सुरक्षित प्रक्रिया सुनिश्चित करने के लिए प्रशिक्षण की आवश्यकता है। इसके अलावा, घाव बंद करने के लिए चीरा के दौरान त्वचा को अनावश्यक नुकसान नहीं देने पर अत्यधिक निर्भर है. प्रोटोकॉल 12 जानवरों की एक यादृच्छिक अध्ययन में किया गया था.
Introduction
इस अध्ययन के समग्र लक्ष्य के लिए एक नियंत्रित और reproduible microsurgical विधि axolotl(Ambystoma mexicanum)को कुंद और तेज एससीआई दण्ड के लिए स्थापित किया गया था, एक पुनर्योजी रीढ़ की हड्डी की चोट मॉडल का उत्पादन.
एससीआई एक गंभीर स्थिति है कि, स्तर और सीमा के आधार पर, बिगड़ा मूत्राशय और आंत्र नियंत्रण1,2,3के साथ हिस्सों के लिए तंत्रिका संबंधी विकलांगता infects . अधिकांश एससीआई उच्च ऊर्जा कुंद आघात का परिणाम है जैसे कि यातायात दुर्घटनाएं और गिर जाती है4,5. तेज चोटों बहुत दुर्लभ हैं. इसलिए, सबसे आम स्थूल चोट प्रकार contusions है.
स्तनधारी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) एक गैर-पुनर्योजी ऊतक है, इसलिए एससीआई के बाद स्नायविक ऊतक की कोई बहाली6,7,8देखी जाती है । दूसरी ओर, कुछ जानवरों के ऊतकों को पुनर्जीवित करने के लिए एक पेचीदा क्षमता है, सीएनएस ऊतक सहित. इन जानवरों में से एक एक्सोलोटल है। यह व्यापक रूप से पुनर्योजी जीव विज्ञान के अध्ययन में प्रयोग किया जाता है और रीढ़ की हड्डी के पुनर्जनन में रुचि का है, क्योंकि यह एक कशेरुकी9,10,11,12है .
एक्सोलोटल में अधिकांश एससीआई अध्ययन या तो पूरी पूंछ के विच्छेदन या रीढ़ की हड्डी9,10,11,12के एक बड़े हिस्से के ablation के रूप में प्रदर्शन कर रहे हैं . हाल ही में, एक नया अध्ययन कुंद चोटों पर प्रकाशित किया गया था13 कि नैदानिक स्थितियों बेहतर नकल करता है. जबकि अक्षलोक में पूर्ण परिशिष्ट विच्छेदन पूर्ण पुनर्जनन में परिणाम है, कुछ गैर-एम्प्यूटेशन-आधारित पुनर्योजी घटनाएं महत्वपूर्ण आकार दोष (सीएसडी)14,15पर निर्भर हैं। इसका मतलब यह है कि एक महत्वपूर्ण सीमा से अधिक चोटों पुनर्जीवित नहीं कर रहे हैं. एक उच्च नैदानिक अनुवाद मूल्य के साथ एक पुनर्योजी मॉडल विकसित करने के लिए, इस अध्ययन की जांच की कि क्या एक 2 मिमी कुंद आघात CSD सीमा से अधिक होगा.
इस विधि छोटे पशु मॉडल में रीढ़ की हड्डी पुनर्जनन पर काम कर रहे शोधकर्ताओं के लिए प्रासंगिक है, विशेष रूप से axolotl में. इसके अलावा, यह अधिक सामान्य हित का हो सकता है, क्योंकि यह मानक प्रयोगशाला उपकरण का उपयोग करने के लिए एक कुंद आघात तंत्र है कि सामान्य रूप में छोटे जानवरों में उपयोग के लिए उपयुक्त है विकसित करने का एक तरीका दर्शाती है.
Protocol
Representative Results
Discussion
क्योंकि रीढ़ की हड्डी में चोट का खतरा महत्वपूर्ण है, प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम spinous प्रक्रियाओं को हटा रहे हैं और रीढ़ की हड्डी के लिए बोनी का उपयोग को चौड़ा अगर जरूरत है. प्रोटोकॉल में उल्लेख के रूप मे?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
माइकल Pedersen, अपनी विशेषज्ञता और एमआरआई प्रोटोकॉल के विकास और पूरी परियोजना की स्थापना पर समय के लिए Aarhus विश्वविद्यालय. पीटर Agger, अपनी विशेषज्ञता और एमआरआई प्रोटोकॉल के विकास पर समय के लिए Aarhus विश्वविद्यालय. Steffen Ringgard, अपनी विशेषज्ञता और एमआरआई प्रोटोकॉल के विकास पर समय के लिए Aarhus विश्वविद्यालय. Axolotl में SCI मॉडल के विकास कृपया A.P. M$ller Maersk फाउंडेशन, Riisfort फाउंडेशन, Linex फाउंडेशन, और ELRO फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g – 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| kimwipes | |||
| microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
- Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).
- Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. Bladder management and quality of life after spinal cord injury. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).
- Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population. Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).
- Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study. Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).
- Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).
- Aguayo, A. J., et al. Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).
- Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum. Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).
- Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. Regeneration of long spinal axons in the rat. Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).
- Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).
- Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat. Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).
- Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl. Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).
- McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres. Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).
- Thygesen, M. M., et al. A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail. Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).
- Goss, R. J. . Principles of Regeneration. , (1969).
- Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing. Bone. 40 (1), 45-56 (2007).
- Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
