Använda en extracellulär Flux-analysator för att mäta förändringar i glykolys och oxidativ fosforylering under mus spermie kapacitet
Summary
Vi beskriver tillämpningen av en extracellulär Flux Analyzer för att övervaka realtids förändringar i glykolys och oxidativ fosforylering under mus spermie kapacitet.
Abstract
Spermier från däggdjur förvärvar fertiliseringsförmåga i de kvinnliga reproduktionsorganen i en process som kallas kapacitet. Kapacitet-associerade processer kräver energi. Det återstår en pågående debatt om de källor som genererar ATP som bränslen spermier progressiv motilitet, kapacitet, hyperaktivering, och acrosome reaktion. Här beskriver vi tillämpningen av en extracellulär Flux Analyzer som ett verktyg för att analysera förändringar i energimetabolism under mus spermie kapacitet. Med hjälp av H+-och O2-känsliga fluoroforer, denna metod gör det möjligt att övervaka glykolys och oxidativ fosforylering i realtid i icke-kondenserad kontra politiker spermier. Med hjälp av denna analys i närvaro av olika energisubstrat och/eller farmakologiska aktivatorer och/eller hämmare kan ge viktiga insikter i bidraget från olika metaboliska vägar och skärningspunkten mellan signalering kaskader och metabolism under sperma kapacitet.
Introduction
Tillämpningen av masspektrometri har revolutionerat studiet av metabolism. Riktad metabolisk profilering och metabolomiska spårning möjliggöra noggrann övervakning av förändringar i energimetabolism. Emellertid, utför metabolomik framgångsrikt kräver omfattande utbildning, erfaren personal, och dyra, mycket känsliga masspektrometrar inte lätt tillgängliga för varje laboratorium. Under de senaste åren, med hjälp av en extracellulär Flux Analyzer, såsom Seahorse XFe96 har vuxit populär som en surrogat metod för att mäta förändringar i energimetabolism i olika celltyper1,2,3,4,5.
Spermier är mycket specialiserade motila celler; vars uppgift är att leverera det faderliga genomet till äggocyten. Sperma som lämnar de manliga reproduktionsorganen efter utlösning är fortfarande funktionellt omogen och kan inte befrukta äggcell eftersom de inte kan tränga in i oocyters skruvor. Spermier förvärva fertilisering kompetens som de transitering genom den kvinnliga reproduktionsorganen i en mognande process som kallas capacitation6,7. Nyligen ejakulerade spermier eller spermier dissekeras från cauda bitestiklarna kan kapas in vitro genom inkubation i definierade kapacitet media som innehåller ca2 +, bikarbonat (HCO3–) eller en cell-permeable Camp analog (t. ex., dibutyryl-Camp), en kolesterol acceptor (t. ex., bovint serum albumin, BSA), och en energikälla (t. ex., glukos). Under kapacitet, spermier ändra deras motilitet mönster i en asymmetrisk flagellar Beat, som representerar en simning läge som kallas hyperaktivering8,9, och de blir behöriga att genomgå den acrosome reaktion7, där proteolytiska enzymer frigörs att smälta oocyterna ‘ s vestments. Dessa processer kräver energi, och liknar somatiska celler, spermier generera ATP och andra hög energi föreningar via glykolys samt mitokondriell TCA cykel och oxidativ fosforylering (oxfos)10. Medan flera studier visar att glykolys är nödvändig och tillräcklig för att stödja spermier kapacitet11,12,13,14, bidraget av oxfos är mindre tydlig. I motsats till andra celltyper där glykolys är fysiskt kopplad till TCA-cykeln, spermier är mycket uppdelade och tros upprätthålla dessa processer i separata flagellar utrymmen: den midpiece koncentrerar mitokondriella maskiner, medan de viktigaste enzymerna av glykolys verkar vara begränsad till den viktigaste pjäs15,16. Denna uppdelning resulterar i en pågående debatt om huruvida pyruvat produceras i huvuddelen av glykolys kan stödja mitokondriella oxfos i mittpunkten, och om ATP produceras av oxfos i mellanstycket skulle kunna sprida tillräckligt snabbt längs längden av flagellen se att stödja energibehovet i distala delar av det viktigaste pjäs17,18,19. Det finns också stöd för en roll för oxfos i spermie kapacitet. Inte bara oxfos mer energiskt gynnsam än glykolys, genererar 16 gånger mer ATP än glykolys, men midpiece volym och mitokondriellt innehåll är direkt korrelerade med reproduktiv kondition i däggdjursarter som uppvisar större grad av konkurrens mellan män för kompisar20. Att ta itu med dessa frågor kräver metoder för att undersöka de relativa bidragen från glykolys och oxfos under spermie kapacitet.
Tourmente et al. tillämpat en 24-brunn extracellulär Flux Analyzer för att jämföra energimetabolism av närbesläktade mus arter med betydligt olika spermie prestandaparametrar21. Istället för att rapportera de basala ECAR och OCR värden av icke-kondenserad sperma, här anpassar vi sin metod med hjälp av en 96-väl extracellulära Flux Analyzer för att övervaka förändringar i energimetabolism under mus spermier kapacitet i realtid. Vi utvecklade en metod som gör det möjligt att samtidigt övervaka glykolys och oxfos i realtid i spermier med att slå flageller i upp till tolv olika experimentella förhållanden genom att mäta flödet av syre (O2) och protoner (H+) (figur 1a). På grund av nedbrytningen av pyruvat till laktat under glykolys och produktion av CO2 via TCA-cykeln, icke-kondenserad och kondenserad sperma extrudera H+ in i analysen media som upptäcks av extracellulära Flux Analyzer via H+-känsliga fluoroforer immobiliserade till sonden spetsen av en sensor patron. Parallellt med detta upptäcks O2 -konsumtionen genom oxidativ fosforylering via O2-känsliga fluoroforer immobiliserade till samma sond spets (figur 1b). Effektiv detektering av den släppta H+ och konsumeras O2 kräver en modifierad spermie buffert med låg buffring kapacitet utan bikarbonat eller fenolrött. Sålunda, för att inducera kapacitet i avsaknad av bikarbonat, vi antog användningen av en cell-permeable cAMP analog injiceras tillsammans med brett spektrum PDE inhibitor IBMX22. Tre ytterligare oberoende injektions portar möjliggör injektion av farmakologiska aktivatorer och/eller hämmare, vilket underlättar realtidsdetektering av förändringar i cellandningen och glykolysfrekvens på grund av experimentell manipulation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förlusten av spermie kapacitet i avsaknad av vissa metaboliska substrat eller kritiska metaboliska enzymer avslöjade energimetabolism som en nyckelfaktor som stöder framgångsrik befruktning. En metabolisk switch under cell aktivering är ett väletablerat begrepp i andra celltyper, men vi är bara börjar förstå hur spermier anpassa sin metabolism till den ökande efterfrågan på energi under kapacitet. Med hjälp av en extracellulär Flux Analyzer utvecklade vi ett lätt tillämpligt verktyg för att övervaka f?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna stöd från Dr Lavoisier Ramos-Espiritu på Rockefeller hög genomströmning och spektroskopi Resource Center.
Materials
| Reagents | |||
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A1470 | BSA |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) | Sigma-Aldrich | L7381 | ConA |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 1169567761 | Isoflurane |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3- |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment and materials | |||
| 12 channel pipette 10-100 μL | eppendorf | ES-12-100 | |
| 12 channel pipette 50-300 μL | vwr | 613-5257 | |
| 37 °C, non-CO2 incubator | vwr | 1545 | |
| 5 mL cetrifuge tubes | eppendorf | 30119380 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | vwr | 76211-286 | |
| Centrifuge with plate adapter | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| Dissection kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Inverted phase contrast microscope with 40X objective | Nikon | ||
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided | Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges. |
References
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T. Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).
- Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).
- de Groof, A. J., et al. Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype. Molecular Cancer. 8, 54 (2009).
- Chao, L. C., et al. Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77. Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).
- Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).
- Austin, C. R., Bishop, M. W. Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).
- Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).
- Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
- Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O’Brien, D. A. Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation. Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose. Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).
- Danshina, P. V., et al. Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice. Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).
- Miki, K., et al. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).
- Mori, C., et al. Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail. Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).
- Westhoff, D., Kamp, G. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa. Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).
- Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. Diffusion of ATP in sperm flagella. Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).
- Adam, D. E., Wei, J. Mass transport of ATP within the motile sperm. Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).
- Tombes, R. M., Shapiro, B. M. Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).
- Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size. Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).
- Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species. Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).
- Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).
- Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals. PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).
- Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).
- Morgan, D. J., et al. Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation. PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).
