باستخدام محلل الجريان خارج الخلية لقياس التغيرات في تحلل الجلوكوز والاكسده اثناء الماوس العنبر التقوية
Summary
ونحن وصف تطبيق محلل تدفق خارج الخلية لرصد التغيرات في الوقت الحقيقي في تحلل الجلوكوز والمؤكسدة اثناء الماوس السائل المنوي.
Abstract
وتكتسب النطاف في الثدييات قدره علي الإخصاب في الجهاز التناسلي الأنثوي في عمليه تعرف بالسعة الاستيعابية. تتطلب العمليات المرتبطة بالسعة الطاقة. لا يزال هناك نقاش مستمر حول المصادر التي تولد ATP التي تغذي النطاف الحركية التقدمية ، والسعه ، وفرط النشاط ، والتفاعل الزائد. هنا ، ونحن وصف تطبيق محلل تدفق خارج الخلية كاداه لتحليل التغيرات في استقلاب الطاقة خلال الماوس السائل المنوي. باستخدام الفلور الحساسةH +و O2، يسمح هذا الأسلوب بمراقبه تحلل الجلوكوز والاكسده المؤكسدة في الوقت الحقيقي في غير السعه مقابل السائل المنوي. استخدام هذا الفحص في وجود ركائز الطاقة المختلفة و/أو المنشطات الدوائية و/أو مثبطات يمكن ان توفر رؤى هامه في مساهمه المسارات الايضيه المختلفة والتقاطع بين الإشارات التعاقبية والأيض اثناء السائل المنوي.
Introduction
وقد أحدث تطبيق الطيف الكتلي ثوره في دراسة الأيض. التنميط الأيضي المستهدف وتتبع الأيض يسمح برصد دقيق للتغيرات في استقلاب الطاقة. ومع ذلك ، يتطلب أداء الأيض بنجاح التدريب المكثف ، والموظفين ذوي الخبرة ، وباهظه الثمن ، والأطياف الشاملة عاليه الحساسية ليست متاحه بسهوله لكل مختبر. في السنوات الاخيره ، باستخدام محلل تدفق خارج الخلية ، مثل فرس الحصان XFe96 نمت شعبيه كوسيلة بديله لقياس التغيرات في استقلاب الطاقة في مختلف أنواع الخلايا1،2،3،4،5.
السائل المنوي هي خلايا متحرك المتخصصة للغاية. مهمتها هي تسليم الجينوم الأبوي إلى البويضة. العنبر ترك الجهاز التناسلي الذكور بعد القذف لا تزال غير ناضجه وظيفيا ولا يمكن تخصيب البويضة لأنهم غير قادرين علي اختراق الخلايا الدهنية ‘ الأثواب. المني اكتساب كفاءه الإخصاب لأنها العبور من خلال الجهاز التناسلي الأنثوي في عمليه النضج المعروفة باسم السعه6,7. يمكن ان يكون السائل المنوي القذف الطازج أو السائل المنوي الذي يتم تشريحه من البربخ في المختبر عن طريق الحضانة في وسائل الاعلام المحددة التي تحتوي علي Ca2 +، بيكربونات (hco3–) أو التناظرية الخلية-المخيم نفاذيه (علي سبيل المثال ، dibutyryl-مخيم) ، متقبل الكولسترول (مثل الزلال مصل البقر ، جيش صرب البوسنيين) ، ومصدر للطاقة (علي سبيل المثال ، الجلوكوز). اثناء التاهيل ، وتعديل السائل المنوي نمط الحركة في فوز الصواري غير المتناظرة ، والتي تمثل وضع السباحة يسمي فرط التنشيط8،9، وانها تصبح المختصة للخضوع لرد فعل اكروبعض7، حيث يتم الإفراج عن الانزيمات البروتينية التي هضم البويضات ‘ vestments. هذه العمليات تتطلب الطاقة ، ومماثله للخلايا الجسدية ، والسائل المنوي توليد ATP وغيرها من مركبات الطاقة العالية عن طريق تحلل الخلايا ، فضلا عن دوره المركبات الفوسفاتية المتقدريه والاكسده فوسفولات (oxphos)10. في حين تبين دراسات متعددة ان تحلل الجلوكوز ضروري وكافي لدعم السائل المنوي السعه11,12,13,14, مساهمه oxphos اقل وضوحا. وخلافا لأنواع الخلايا الأخرى حيث يتم اقتران تحلل الجلوكوز جسديا بدوره الهيئة ، فان السائل المنوي مجزا إلى حد كبير ويعتقد انه يحافظ علي هذه العمليات في مقصورات الصواري المنفصلة: ويركز الجزء الأوسط علي آلاتالميتوكوندريا ، فيحين ان الانزيمات الرئيسية لتحلل الجلوكوز تبدومقيده. نتائج هذا التقسيم في نقاش مستمر حول ما إذا كان بيروفات المنتجة في القطعة الرئيسية من غليكولسيس يمكن ان تدعم oxphos الميتوكوندريا في midpiece ، وما إذا كان ATP التي تنتجها oxphos في midpiece تكون قادره علي نشر بسرعة كافيه علي طول السارية لدعم متطلبات الطاقة في الأجزاء البعيدة من القطعة الرئيسية17،18 وهناك أيضا دعم لدور اوكسنفوس في السائل المنوي. ليس فقط هو oxphos أكثر نشاطا مواتيه من تحلل, توليد 16 مرات أكثر ATP من تحلل, ولكن حجم midpiece ومحتوي الميتوكوندريا ترتبط مباشره مع اللياقة الانجابيه في الأنواع الثدييات التي تظهر درجات أكبر من المنافسة بين الذكور لأصحاب20. معالجه هذه الاسئله يتطلب أساليب لدراسة المساهمات النسبية لتحلل الجلوكوز والاكسده اثناء السائل المنوي.
تورمنت وآخرون تطبيق محلل تدفق خارج الخلية 24 جيدا لمقارنه الأيض الطاقة من الأنواع الماوس ذات الصلة بشكل وثيق مع مختلفه بشكل ملحوظ معلمات أداء العنبر21. بدلا من الإبلاغ عن قيم ECAR و OCR القاعدية للنطفة غير القادرة ، هنا ، فاننا نكيف طريقتهم باستخدام محلل تدفق خارج الخلية 96 لمراقبه التغيرات في استقلاب الطاقة خلال الماوس السائل المنوي في الوقت الحقيقي. قمنا بتطوير طريقه تسمح في الوقت نفسه رصد تحلل الجلوكوز و oxphos في الزمن الحقيقي في السائل المنوي مع الضرب الصواري في ما يصل إلى اثني عشر ظروف التجريبية المختلفة عن طريق قياس تدفق الأكسجين (O2) والبروتونات (H +) (الشكل 1a). نظرا لانهيار بيروفات إلى اللاكتات اثناء تحلل الجلوكوز وإنتاج CO 2 عن طريق الدورةالثانية والعشرين ، وعدم السعه والسعه المنوية البثقh + في وسائل الفحص التي يتم الكشف عنها من قبل محلل تدفق خارج الخلية عن طريقh +-الحساسة فلوبوريس إلى طرف التحقيق من خرطوشه الاستشعار. وفي موازاة ذلك ، يتم الكشف عن الاستهلاك O2 بواسطة فوسفولات الاكسده عن طريق o2-الحساسة الفلوروهورس التي تم تعبئتها لنفس التحقيق غيض (الشكل 1b). الكشف الفعال عنH + والمستهلكة س2 يتطلب المخزن المؤقت السائل المنوي المعدل مع انخفاض القدرة التخزين المؤقت دون بيكربونات أو الفينول الأحمر. التالي ، للحث علي السعه في غياب بيكربونات ، اعتمدنا استخدام التناظرية الخلية-نفاذيه مخيم حقن مع المثبط PDE واسعه النطاق IBMX22. ثلاثه منافذ حقن مستقله اضافيه تسمح بحقن المنشطات الدوائية و/أو مثبطات, مما يسهل الكشف في الوقت الحقيقي من التغيرات في التنفس الخلوي ومعدل تحلل الجلوكوز بسبب التلاعب التجريبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد كشف فقدان القدرة المنوية للمني في غياب بعض الركائز الايضيه أو الانزيمات الايضيه الحرجة عن استقلاب الطاقة كعامل رئيسي يدعم الإخصاب الناجح. التبديل الأيضي اثناء تنشيط الخلية هو مفهوم راسخ في أنواع الخلايا الأخرى ، ومع ذلك ، نحن مجرد بداية لفهم كيف السائل المنوي تكييف الأيض لزيادة الطلب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود أصحاب البلاغ ان ينووا بالدعم المقدم من الدكتور لافازييه راموس-اسبسيتو في مركز روكفلر للموارد العالية الانتاجيه والطيفية.
Materials
| Reagents | |||
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A1470 | BSA |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) | Sigma-Aldrich | L7381 | ConA |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 1169567761 | Isoflurane |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3- |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment and materials | |||
| 12 channel pipette 10-100 μL | eppendorf | ES-12-100 | |
| 12 channel pipette 50-300 μL | vwr | 613-5257 | |
| 37 °C, non-CO2 incubator | vwr | 1545 | |
| 5 mL cetrifuge tubes | eppendorf | 30119380 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | vwr | 76211-286 | |
| Centrifuge with plate adapter | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| Dissection kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Inverted phase contrast microscope with 40X objective | Nikon | ||
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided | Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges. |
References
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T. Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).
- Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).
- de Groof, A. J., et al. Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype. Molecular Cancer. 8, 54 (2009).
- Chao, L. C., et al. Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77. Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).
- Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).
- Austin, C. R., Bishop, M. W. Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).
- Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).
- Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
- Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O’Brien, D. A. Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation. Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose. Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).
- Danshina, P. V., et al. Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice. Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).
- Miki, K., et al. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).
- Mori, C., et al. Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail. Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).
- Westhoff, D., Kamp, G. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa. Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).
- Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. Diffusion of ATP in sperm flagella. Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).
- Adam, D. E., Wei, J. Mass transport of ATP within the motile sperm. Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).
- Tombes, R. M., Shapiro, B. M. Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).
- Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size. Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).
- Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species. Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).
- Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).
- Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals. PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).
- Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).
- Morgan, D. J., et al. Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation. PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).
