Met behulp van een extracellulaire flux Analyzer om veranderingen in glycolyse en oxidatieve fosforylering te meten tijdens het gebruik van muis sperma
Summary
We beschrijven de toepassing van een extracellulaire flux-Analyzer om real-time veranderingen in de glycolyse en oxidatieve fosforylering tijdens het gebruik van muis sperma te bewaken.
Abstract
Sperma van zoogdieren verkrijgt bevruchting in het vrouwelijke voortplantingsstelsel in een proces dat bekend staat als capaciteitsopbouw. Capacitatie-geassocieerde processen vereisen energie. Er blijft een voortdurende discussie over de bronnen genereren van de ATP die brandstoffen sperma progressieve beweeglijkheid, capacitatie, hyperactivation, en acrosome reactie. Hier beschrijven we de toepassing van een extracellulaire flux-analysator als een hulpmiddel om veranderingen in het energiemetabolisme te analyseren tijdens het gebruik van muis sperma capaciteit. Met behulp van H+-en O2-gevoelige fluoroforen, maakt deze methode het mogelijk om de glycolyse en oxidatieve fosforylering in real-time te monitoren in niet-bekwame versus capaciteit van sperma. Het gebruik van deze test in de aanwezigheid van verschillende energie substraten en/of farmacologische activatoren en/of remmers kan belangrijke inzichten geven in de bijdrage van verschillende metabole trajecten en het snijpunt tussen signalering van Cascades en metabolisme tijdens het gebruik van sperma.
Introduction
De toepassing van massaspectrometrie heeft een revolutie teweeggebracht in de studie van het metabolisme. Gerichte metabole profilering en metabolomic tracing zorgen voor nauwkeurige monitoring van veranderingen in het energiemetabolisme. Echter, het uitvoeren van metabolomica met succes vereist uitgebreide training, ervaren personeel, en dure, zeer gevoelige massaspectrometers niet gemakkelijk beschikbaar voor elk laboratorium. In de afgelopen jaren is het gebruik van een extracellulaire flux analysator, zoals de Seahorse XFe96, populair geworden als een surrogaat methode voor het meten van veranderingen in het energiemetabolisme in verschillende celtypen1,2,3,4,5.
Sperma zijn zeer gespecialiseerde beweeglijke cellen; waarvan de taak is om het vaderlijke genoom aan de eicel te leveren. Sperma dat het mannelijke voortplantingsstelsel na de ejaculatie verlaat, is nog steeds functioneel onrijp en kan de eicel niet bevruchten omdat ze niet in staat zijn om de vestments van de eicellen te penetreren. Sperma verwerven bemesting competentie als ze doorgeven door het vrouwelijke voortplantingskanaal in een rijpingsproces bekend als capacitatie6,7. Vers ejaculeerd sperma of sperma uit de Cauda epididymis kan in vitro worden bekwaam door incubatie in gedefinieerde capacitatiemedia met CA2 +, bicarbonaat (HCO3–) of een cel-permeabel kamp analoog (bijv. dibutyryl-Camp), een cholesterol acceptor (bv. Runderalbumine, BSA) en een energiebron (bijv. glucose). Tijdens de capaciteits wijziging wijzigt het sperma hun motiliteits patroon in een asymmetrische flagellar-beat, die een zwemmodus met de naam Hyper activatie8,9vertegenwoordigt, en ze worden bekwaam om de acrosome-reactie7te ondergaan, waar Proteolytische enzymen vrijkomen die de vesteringen van de eicellen verteren. Deze processen vereisen energie, en vergelijkbaar met somatische cellen, sperma genereren ATP en andere hoge energieverbindingen via glycolyse, alsmede mitochondriale TCA-cyclus en oxidatieve fosforylering (oxphos)10. Terwijl meerdere studies aantonen dat glycolyse noodzakelijk en voldoende is voor de ondersteuning van sperma capaciteit11,12,13,14, is de bijdrage van oxphos minder duidelijk. In tegenstelling tot andere celtypen waar glycolyse fysiek gekoppeld is aan de TCA-cyclus, worden sperma sterk gecompartialiseerd en wordt gedacht dat het deze processen in aparte flagellar-compartimenten handhaaft: het middenstuk concentreert de mitochondriale machines, terwijl de belangrijkste enzymen van glycolyse lijken te worden beperkt tot het hoofdstuk15,16. Deze compartimenging leidt tot een voortdurende discussie over de vraag of pyruvaat geproduceerd in het hoofdstuk door glycolyse mitochondriale oxphos in het middenstuk kan ondersteunen, en of ATP geproduceerd door oxphos in het middenstuk zou kunnen diffuus voldoende snel over de lengte van het flagellum ter ondersteuning van de energie-eisen in distale delen van het hoofdstuk17,18,19. Er is ook ondersteuning van een rol voor oxphos in sperma-capacitatie. Niet alleen is oxphos meer energetisch gunstiger dan glycolyse, het genereren van 16 keer meer ATP dan glycolyse, maar het middenstuk volume en de mitochondriale inhoud zijn direct gecorreleerd met reproductieve fitness in zoogdieren soorten die grotere mate van competitie tussen mannen voor mates20vertonen. Het aanpakken van deze vragen vereist methoden voor het onderzoeken van de relatieve bijdragen van glycolyse en oxphos tijdens de capaciteitstoewijzing van sperma.
Tourmente et al. paste een 24-Well extracellulaire flux Analyzer aan om het energiemetabolisme van nauw verwante muis soorten te vergelijken met significant verschillende sperma prestatieparameters21. In plaats van het rapporteren van de basale ECAR en OCR waarden van niet-bekwame sperma, hier, we passen hun methode met behulp van een 96-well extracellulaire flux Analyzer om veranderingen in het energiemetabolisme tijdens de muis sperma capaciteit in real-time te bewaken. We ontwikkelden een methode die gelijktijdige controle van glycolyse en oxphos in real-time in sperma mogelijk maakt met het verslaan van flagella in maximaal twaalf verschillende experimentele omstandigheden door het meten van de flux van zuurstof (O2) en protonen (H+) (Figuur 1a). Als gevolg van de afbraak van pyruvaat tot lactaat tijdens de glycolyse en de productie van co2 via de TCA-cyclus, niet-bekwaam en bekwaam sperma extruderen H+ in de assay media die worden gedetecteerd door de extracellulaire flux Analyzer via H+-gevoelige fluor Foren geïmmobiliseerd tot de sondepunt van een sensor cartridge. Parallel, O2 verbruik door oxidatieve fosforylering wordt gedetecteerd via O2-gevoelige fluoroforen geïmmobiliseerd tot dezelfde sonde tip (Figuur 1b). Effectieve detectie van de vrijgegeven H+ en verbruikt O2 vereist een gemodificeerde sperma buffer met lage buffercapaciteit zonder bicarbonaat of fenolrood. Dus, om te induceren van de capaciteit in de afwezigheid van bicarbonaat, we adopteren het gebruik van een cel-permeabel kamp analoog geïnjecteerd samen met de breed-Range PDE inhibitor IBMX22. Drie extra onafhankelijke injectie poorten maken de injectie mogelijk van farmacologische activatoren en/of remmers, die real-time detectie van veranderingen in cellulaire ademhaling en glycolyse snelheid vergemakkelijkt als gevolg van experimentele manipulatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het verlies van sperma capaciteit in de afwezigheid van bepaalde metabole substraten of kritische metabole enzymen onthulde energiemetabolisme als een belangrijke factor die succesvolle bevruchting ondersteunt. Een metabole schakelaar tijdens de activering van de cel is een gevestigde concept in andere celtypen, echter, we zijn net beginnen te begrijpen hoe sperma hun metabolisme aan te passen aan de toenemende energievraag tijdens de capacitatie. Met behulp van een extracellulaire flux Analyzer ontwikkelden we een eenvo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de steun van Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu op het Rockefeller High throughput en spectroscopy Resource Center bevestigen.
Materials
| Reagents | |||
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A1470 | BSA |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) | Sigma-Aldrich | L7381 | ConA |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 1169567761 | Isoflurane |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3- |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment and materials | |||
| 12 channel pipette 10-100 μL | eppendorf | ES-12-100 | |
| 12 channel pipette 50-300 μL | vwr | 613-5257 | |
| 37 °C, non-CO2 incubator | vwr | 1545 | |
| 5 mL cetrifuge tubes | eppendorf | 30119380 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | vwr | 76211-286 | |
| Centrifuge with plate adapter | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| Dissection kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Inverted phase contrast microscope with 40X objective | Nikon | ||
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided | Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges. |
References
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T. Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).
- Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).
- de Groof, A. J., et al. Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype. Molecular Cancer. 8, 54 (2009).
- Chao, L. C., et al. Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77. Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).
- Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).
- Austin, C. R., Bishop, M. W. Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).
- Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).
- Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
- Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O’Brien, D. A. Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation. Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose. Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).
- Danshina, P. V., et al. Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice. Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).
- Miki, K., et al. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).
- Mori, C., et al. Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail. Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).
- Westhoff, D., Kamp, G. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa. Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).
- Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. Diffusion of ATP in sperm flagella. Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).
- Adam, D. E., Wei, J. Mass transport of ATP within the motile sperm. Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).
- Tombes, R. M., Shapiro, B. M. Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).
- Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size. Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).
- Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species. Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).
- Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).
- Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals. PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).
- Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).
- Morgan, D. J., et al. Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation. PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).
