Utilisation d'un analyseur de flux extracellulaire pour mesurer les changements dans la glycolyse et la phosphorylation oxydative pendant la capacitation de sperme de souris
Summary
Nous décrivons l’application d’un analyseur extracellulaire de flux pour surveiller des changements en temps réel dans la glycolyse et la phosphorylation oxydative pendant la capacitation de sperme de souris.
Abstract
Le sperme de mammifères acquiert la capacité de fertilisation dans l’appareil reproducteur femelle dans un processus connu sous le nom de capacitation. Les processus associés à la capacitation nécessitent de l’énergie. Il reste un débat continu au sujet des sources générant l’ATP qui alimente la motilité progressive de sperme, la capacitation, l’hyperactivation, et la réaction acrosome. Ici, nous décrivons l’application d’un analyseur extracellulaire de flux comme outil pour analyser des changements dans le métabolisme énergétique pendant la capacitation de sperme de souris. À l’aide de h–et O2– fluorophores sensibles, cette méthode permet de surveiller la glycolyse et la phosphorylation oxydative en temps réel chez les spermatozoïdes non capacitated versus capacitating. L’utilisation de cet analyse en présence de différents substrats énergétiques et/ou d’activateurs pharmacologiques et/ou d’inhibiteurs peut fournir des informations importantes sur la contribution de différentes voies métaboliques et l’intersection entre les cascades de signalisation et le métabolisme pendant la capacitation des spermatozoïdes.
Introduction
L’application de la spectrométrie de masse a révolutionné l’étude du métabolisme. Le profilage métabolique ciblé et le traçage métabolomique permettent une surveillance précise des changements dans le métabolisme énergétique. Cependant, l’exécution de la métabolomique nécessite une formation approfondie, un personnel expérimenté et des spectromètres de masse coûteux et très sensibles qui ne sont pas facilement accessibles à tous les laboratoires. Ces dernières années, l’utilisation d’un analyseur de flux extracellulaire, comme l’hippocampe XFe96 est devenu populaire comme une méthode de substitution pour mesurer les changements dans le métabolisme énergétique dans divers types de cellules1,2,3,4,5.
Les spermatozoïdes sont des cellules motiles hautement spécialisées; dont la tâche est de livrer le génome paternel à l’ovocyte. Les spermatozoïdes quittant l’appareil reproducteur masculin après l’éjaculation sont encore fonctionnellement immatures et ne peuvent pas féconder l’ovocyte parce qu’ils sont incapables de pénétrer les vêtements des ovocytes. Le sperme acquiert la compétence de fertilisation pendant qu’ils transitent par l’appareil reproducteur femelle dans un processus de maturation connu sous le nom de capacitation6,7. Les spermatozoïdes ou spermatozoïdes fraîchement éjaculés disséqués de l’épididyme cauda peuvent être concoctées in vitro par incubation dans des supports de capacitation définis contenant Ca2,bicarbonate (HCO3–) ou un analogue cAMP perméable à la cellule (p. ex., dibutyryl-cAMP), un accepteur de cholestérol (p. ex. albumine de sérum bovin, BSA) et une source d’énergie (p. ex. glucose). Pendant la capacitation, les spermatozoïdes modifient leur modèle de motilité en un battement asymétrique de flagellaire, représentant un mode de natation appelé hyperactivation8,9, et ils deviennent compétents pour subir la réaction acrosome7, où des enzymes protéolytiques sont libérées qui digèrent les vêtements des ovocytes. Ces processus nécessitent de l’énergie, et similaires aux cellules somatiques, les spermatozoïdes génèrent de l’ATP et d’autres composés à haute énergie par glycolyse ainsi que le cycle mitochondrial TCA et la phosphorylation oxydative (oxphos)10. Tandis que les études multiples démontrent que la glycolyse est nécessaire et suffisante pour soutenir la capacitation de sperme11,12,13,14, la contribution de l’oxphos est moins claire. Contrairement à d’autres types de cellules où la glycolyse est physiquement couplée au cycle TCA, les spermatozoïdes sont très compartimentés et sont pensés pour maintenir ces processus dans des compartiments de flagellateur séparés: la pièce médiane concentre la machinerie mitochondriale, tandis que les enzymes clés de la glycolyse semblent être limitées à la pièce principale15,16. Cette compartimentation se traduit par un débat en cours sur la question de savoir si le pyruvate produit dans la pièce principale par glycolyse peut soutenir les oxphos mitochondriaux dans la pièce médiane, et si l’ATP produit par les oxphos dans la pièce médiane serait en mesure de diffuser suffisamment rapidement le long de la longueur du flagellum pour soutenir les besoins énergétiques dans les parties distales de la pièce principale17,18,19. Il y a également le soutien d’un rôle pour des oxphos dans la capacitation de sperme. Non seulement les oxphos sont plus favorables énergétiquement que la glycolyse, générant 16 fois plus d’ATP que la glycolyse, mais le volume médian et la teneur mitochondriale sont directement corrélés avec la forme reproductive chez les espèces de mammifères qui présentent de plus grands degrés de concurrence entre les mâles pour les compagnons20. Pour répondre à ces questions, il faut des méthodes pour examiner les contributions relatives de la glycolyse et de l’oxphos pendant la capacitation des spermatozoïdes.
Tourmente et coll. ont appliqué un analyseur de flux extracellulaire de 24 puits pour comparer le métabolisme énergétique d’espèces de souris étroitement apparentées avec des paramètres de performance des spermatozoïdes significativement différents21. Au lieu de rapporter les valeurs basales d’ECAR et d’OCR des spermatozoïdes non-capacitated, ici, nous adaptons leur méthode utilisant un analyseur extracellulaire de flux de 96-bien pour surveiller des changements dans le métabolisme énergétique pendant la capacitation de sperme de souris en temps réel. Nous avons développé une méthode qui permet de surveiller simultanément la glycolyse et les oxphos en temps réel dans les spermatozoïdes avec battre flagelle dans jusqu’à douze conditions expérimentales différentes en mesurant le flux d’oxygène (O2) et les protons (H)(Figure 1A). En raison de la décomposition du pyruvate à lactate pendant la glycolyse et de la production de CO2 via le cycle TCA, les spermatozoïdes non capacitatisés et concitatisés extrudent Hdans le support d’analyse qui sont détectés par l’analyseur de flux extracellulaire par l’intermédiaire des fluorophoressensiblesH-sensibles immobilisés à l’extrémité de la sonde d’une cartouche de capteur. En parallèle, la consommation d’O2 par phosphorylation oxydative est détectée par l’intermédiaire de fluorophores sensibles à l’O2immobilisés à la même pointe de la sonde (Figure 1B). La détection efficace de l’O2 libéréet consommé nécessite un tampon de sperme modifié avec une faible capacité tampon sans bicarbonate ou rouge phénol. Ainsi, pour induire la capacitation en l’absence de bicarbonate, nous avons adopté l’utilisation d’un analogue cAMP perméable à la cellule injecté avec l’inhibiteur de la PDE à large portée IBMX22. Trois autres ports d’injection indépendants permettent l’injection d’activateurs pharmacologiques et/ou d’inhibiteurs, ce qui facilite la détection en temps réel des changements dans la respiration cellulaire et le taux de glycolyse dus à la manipulation expérimentale.
Protocol
Representative Results
Discussion
La perte de la capacitation de sperme en l’absence de certains substrats métaboliques ou enzymes métaboliques critiques a indiqué le métabolisme d’énergie comme facteur clé soutenant la fertilisation réussie. Un commutateur métabolique pendant l’activation cellulaire est un concept bien établi dans d’autres types de cellules, cependant, nous commençons juste à comprendre comment les spermatozoïdes adaptent leur métabolisme à la demande croissante d’énergie pendant la capacitation. À l’aide d’un analyseur …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à souligner le soutien du Dr Lavoisier Ramos-Espiritu au Rockefeller High Throughput and Spectroscopy Resource Center.
Materials
| Reagents | |||
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A1470 | BSA |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) | Sigma-Aldrich | L7381 | ConA |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 1169567761 | Isoflurane |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3- |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment and materials | |||
| 12 channel pipette 10-100 μL | eppendorf | ES-12-100 | |
| 12 channel pipette 50-300 μL | vwr | 613-5257 | |
| 37 °C, non-CO2 incubator | vwr | 1545 | |
| 5 mL cetrifuge tubes | eppendorf | 30119380 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | vwr | 76211-286 | |
| Centrifuge with plate adapter | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| Dissection kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Inverted phase contrast microscope with 40X objective | Nikon | ||
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided | Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges. |
References
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