Utilizzo di un analizzatore di flusso extracellulare per misurare i cambiamenti nella glicolisi e nel fosforo ossidativo durante la capazione dello sperma del mouse

Summary

Descriviamo l’applicazione di un analizzatore di flusso extracellulare per monitorare i cambiamenti in tempo reale nella glicolisi e nel fosforilazione ossidativa durante la capitaneria dello sperma del topo.

Abstract

Lo sperma di mammaliano acquisisce la capacità di fecondazione nel tratto riproduttivo femminile in un processo noto come capacitation. I processi associati alla capitaneria richiedono energia. Resta un dibattito in corso sulle fonti che generano l’ATP che alimenta lo sperma tosilità progressiva, la capitaneria, l’iperattivazione e la reazione acroso. Qui, descriviamo l’applicazione di un analizzatore di flusso extracellulare come strumento per analizzare i cambiamenti nel metabolismo energetico durante la capacitazione dello sperma del topo. Utilizzando^losperma sensibile a fluorofori sensibili H – e O_2,questo metodo consente di monitorare la glicolisi e il fosforo ossidativo in tempo reale in spermatozoi non capacitari e capacitari. L’utilizzo di questo test in presenza di diversi substrati energetici e/o attivatori e/o inibitori farmacologici può fornire importanti informazioni sul contributo di diverse vie metaboliche e l’intersezione tra le cascate di segnalazione e il metabolismo durante la capacitation dello sperma.

Introduction

L’applicazione della spettrometria di massa ha rivoluzionato lo studio del metabolismo. La profilazione metabolica mirata e la tracciatura metabolomica consentono un monitoraggio preciso dei cambiamenti nel metabolismo energetico. Tuttavia, l’esecuzione di metabolomica richiede con successo un’ampia formazione, personale esperto e costosi spettrometri di massa altamente sensibili non prontamente disponibili per ogni laboratorio. Negli ultimi anni, utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare, come il Seahorse XFe96 è diventato popolare come metodo surrogato per misurare i cambiamenti nel metabolismo energetico in vari tipi di cellule^1,2,3^,4,5.

Lo sperma sono cellule motili altamente specializzate; il cui compito è quello di consegnare il genoma paterno all’ovocita. Lo sperma che lascia il tratto riproduttivo maschile dopo l’eiaculazione è ancora funzionalmente immaturo e non può fertilizzare gli ovociti perché non sono in grado di penetrare i paramenti degli ovociti. Lo sperma acquisisce la competenza di fecondazione mentre transitano attraverso il tratto riproduttivo femminile in un processo di maturazione noto come capacitation^6,7. Lo sperma o sperma appena eiaculato sezionato dal cauda epididymis può essere condensato in vitro per incubazione in supporti di capitanatura definiti contenenti Ca^{2 ,}bicarbonato (HCO₃^–) o un analogo cAMP permeabile per le cellule (ad esempio, dibutyryl-cAMP), un accettatore di colesterolo (ad esempio, albumina del siero bovino, BSA) e una fonte di energia (ad esempio, glucosio). Durante la capitazione, gli spermatoi modificano il loro modello di motilità in un battito flagellare asimmetrico, rappresentando una modalità di nuoto chiamata iperattivazione^8,9, e diventano competenti a subire la reazione acrosomi7 , dove vengono rilasciati enzimi proteolitici che digeriscono i paramenti degli ovociti. Questi processi richiedono energia, e simile alle cellule somatiche, sperma generano ATP e altri composti ad alta energia tramite glicolisi così come ciclo TCA mitocondriale e fosforolo ossidativo (opxphos)¹⁰. Mentre studi multipli dimostrano che la glicolisi è necessaria e sufficiente per sostenere la capacità dello sperma^11,12,13,14, il contributo di ophos è meno chiaro. Contrariamente ad altri tipi di cellule in cui la glicolisi è fisicamente accoppiata al ciclo TCA, gli spermatozoi sono altamente compartimentati e si pensa che mantengano questi processi in compartimenti flagellari separati: il midpiece concentra i macchinari mitocondriali, mentre gli enzimi chiave della glicolisi sembrano essere limitati al pezzo principale^15,16. Questa compartimentazione comporta un dibattito in corso sul fatto che il piravate prodotto nel pezzo principale dalla glicolisi possa supportare oxphos mitocondriali nel midpiece, e se l’ATP prodotto da exxphos nel midpiece sarebbe in grado di diffondersi abbastanza rapidamente lungo la lunghezza del flagello per sostenere il fabbisogno energetico in parti distali del pezzo principale^17,18,19. C’è anche il supporto di un ruolo per ophos in capitaneria di sperma. Non solo è oxphos più energeticamente favorevole di glicolisi, generando 16 volte più ATP rispetto alla glicolisi, ma il volume del pezzo in verso e il contenuto mitocondriale sono direttamente correlati con la forma riproduttiva nelle specie di mammiferi che presentano maggiori gradi di concorrenza tra maschi di concorrenza per compagni²⁰. Affrontare queste domande richiede metodi per esaminare i contributi relativi di glicolisi e ophos durante la capitaneria dello sperma.

Tourmente ealtri applicato un analizzatore di flusso extracellulare 24-well per confrontare il metabolismo energetico di specie di topi strettamente correlati con significativamente diversi parametri di prestazioni dello sperma²¹. Invece di riportare i valori basali ECAR e OCR dello sperma non-capacitato, qui, adattiamo il loro metodo utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare di 96 pozzetti per monitorare i cambiamenti nel metabolismo energetico durante la capacità dello sperma del mouse in tempo reale. Abbiamo sviluppato un metodo che permette contemporaneamente di monitorare glicolisi e sfiorare in tempo reale nello sperma con flagelli che battono flagelli in fino a dodici diverse condizioni sperimentali misurando il flusso di ossigeno (O₂) e protoni (H⁾(Figura 1A). A causa della rottura del pirovano al lattato durante la glicolisi e della produzione di CO₂ tramite il ciclo TCA, lo sperma non contraente e condensato extrude H^– nel supporto di analisi che vengono rilevati dall’analizzatore del flusso extracellulare tramite H^–fluofori sensibili immobilizzati sulla punta della sonda di una cartuccia sensore. Parallelamente, il consumo di O₂ mediante fosforoorylazione ossidativa viene rilevato tramite fluorofori sensibili con O₂immobilizzati alla stessa punta della sonda (Figura 1B). La rilevazione efficace dell’H rilasciato e del consumato O₂ richiede un buffer di spermatozoi modificato con bassa capacità di buffering senza bicarbonato o fenolo rosso. Così, per indurre la capatazione in assenza di bicarbonato, abbiamo adottato l’uso di un analogo cAMP permeabile alle cellule iniettato insieme all’inibitore PDE ad ampio raggio IBMX²². Altre tre porte di iniezione indipendenti consentono l’iniezione di attivatori e/o inibitori farmacologici, che facilita il rilevamento in tempo reale dei cambiamenti nella respirazione cellulare e nel tasso di glicolisi a causa di manipolazioni sperimentali.

Protocol

Gli spermatomani sono raccolti da topi maschi CD-1 di 8-16 settimane. Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali di Weill Cornell Medicine (IACUC). 1. Giorno prima del saggio Preparazione della cartuccia del sensore e del calibro dell’analizzatore del flusso extracellulare Per idratare la cartuccia del sensore, rimuovere la cartuccia del sensore dal kit di analisi del flusso extracellular…

Representative Results

Questo metodo utilizza un analizzatore di flusso extracellulare per monitorare i cambiamenti in tempo reale nel tasso di glicolisi e ophos durante la capitaneria dello sperma del mouse. La figura 4 mostra un esperimento esemplare in cui lo sperma era capacitato in presenza di glucosio come unico substrato energetico e 2 DG e antimicina e rotenone come modulatori farmacologici. Il substrato energetico nel buffer TYH dell’analizzatore di flusso extracellulare e…

Discussion

La perdita di capitalizzazione dello sperma in assenza di alcuni substrati metabolici o enzimi metabolici critici ha rivelato il metabolismo energetico come un fattore chiave a sostegno della fecondazione di successo. Un interruttore metabolico durante l’attivazione cellulare è un concetto consolidato in altri tipi di cellule, tuttavia, stiamo appena iniziando a capire come gli spermatofori adattano il loro metabolismo alla crescente domanda di energia durante la capacitation. Utilizzando un analizzatore di flusso extra…

Materials

Reagents
2-Deoxy-D-glucose	Sigma-Aldrich	D8375	2-DG
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A1470	BSA
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016	CaCl2
Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut)	Sigma-Aldrich	L7381	ConA
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Hepes	Sigma-Aldrich	H0887
Isothesia	Henry Schein Animal Health	1169567761	Isoflurane
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643	MgSO4
N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	D0627	db-cAMP
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333	KCl
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P5655	KH2PO4
Rotenone	Cayman Chemical Company	13995	Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	NaHCO3-
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888	NaCl
Equipment and materials
12 channel pipette 10-100 μL	eppendorf	ES-12-100
12 channel pipette 50-300 μL	vwr	613-5257
37 °C, non-CO2 incubator	vwr	1545
5 mL cetrifuge tubes	eppendorf	30119380
50 mL conical centrifuge tubes	vwr	76211-286
Centrifuge with plate adapter	Thermo Scientific	IEC FL40R
Dissection kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Inverted phase contrast microscope with 40X objective	Nikon
OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided	Thomas Scientific	1159X93
OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided	Thomas Scientific	1159X95
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.