Uso de un analizador de flujo extracelular para medir los cambios en la glucólisis y la fosforilación oxidativa durante la capacitación del esperma del ratón
Summary
Describimos la aplicación de un analizador de flujo extracelular para monitorear los cambios en tiempo real en la glucólisis y la fosforilación oxidativa durante la capacitación del esperma del ratón.
Abstract
Los espermatozoides mamíferos adquieren capacidad de fertilización en el tracto reproductivo femenino en un proceso conocido como capacitación. Los procesos asociados a la capacitación requieren energía. Sigue habiendo un debate en curso sobre las fuentes que generan el ATP que alimenta la motilidad progresiva de los espermatozoides, la capacitación, la hiperactivación y la reacción acrosoma. Aquí, describimos la aplicación de un analizador de flujo extracelular como una herramienta para analizar los cambios en el metabolismo energético durante la capacitación del esperma del ratón. Usando fluoróforos sensibles H+– y O2,este método permite monitorear la glucólisis y la fosforilación oxidativa en tiempo real en espermatozoides no capacitados frente a capacitantes. El uso de este ensayo en presencia de diferentes sustratos energéticos y/o activadores farmacológicos y/o inhibidores puede proporcionar información importante sobre la contribución de diferentes vías metabólicas y la intersección entre las cascadas de señalización y el metabolismo durante la capacitación de espermatozoides.
Introduction
La aplicación de la espectrometría de masas ha revolucionado el estudio del metabolismo. El perfilado metabólico dirigido y el rastreo metabolómico permiten un seguimiento preciso de los cambios en el metabolismo energético. Sin embargo, realizar metabolómicas requiere con éxito una amplia formación, personal experimentado y espectrómetros de masas caros y altamente sensibles que no están fácilmente disponibles para todos los laboratorios. En los últimos años, el uso de un analizador de flujo extracelular, como el Seahorse XFe96 se ha popularizando como método sustituto para medir los cambios en el metabolismo energético en varios tipos de células1,2,3,4,5.
Los espermatozoides son células móviles altamente especializadas; cuya tarea es entregar el genoma paterno al ovocitos. Los espermatozoides que salen del tracto reproductivo masculino después de la eyaculación siguen siendo funcionalmente inmaduros y no pueden fertilizar el ovocitos porque son incapaces de penetrar las vestiduras de los ovocitos. Los espermatozoides adquieren competencia de fertilización a medida que transitan por el tracto reproductivo femenino en un proceso de maduración conocido como capacitación6,7. Los espermatozoides o espermatozoides recién eyaculados diseccionados del epidídimo cauda pueden ser capacitados in vitro por incubación en medios de capacitación definidos que contengan Ca2+,bicarbonato (HCO3–) o un análogo de campo permeable a las células (por ejemplo, dibutiryl-cAMP), un aceptador de colesterol (por ejemplo, albúmina de suero de la bolina bovina, BSA) y una fuente de energía (por ejemplo, glucosa). Durante la capacitación, los espermatozoides modifican su patrón de motilidad en un latido flagelante asimétrico, representando un modo de natación llamado hiperactivación8,9, y se vuelven competentes para someterse a la reacción acrosomesa7, donde se liberan enzimas proteolíticas que digieren las vestiduras de los ovocitos. Estos procesos requieren energía, y similar a las células somáticas, espermatozoides generan ATP y otros compuestos de alta energía a través de la glucólisis, así como ciclo de TCA mitocondrial y fosforilación oxidativa (oxfos)10. Mientras que múltiples estudios demuestran que la glucólisis es necesaria y suficiente para apoyar la capacitación de espermatozoides11,12,13,14, la contribución de la oxfos es menos clara. A diferencia de otros tipos de células donde la glucólisis está físicamente acoplada al ciclo TCA, los espermatozoides están altamente compartimentados y se cree que mantienen estos procesos en compartimentos flagelantes separados: la pieza media concentra la maquinaria mitocondrial, mientras que las enzimas clave de la glucólisis parecen limitarse a la pieza principal15,16. Esta compartimentación da lugar a un debate en curso sobre si el piruvato producido en la pieza principal por glicólisis puede soportar oxfos mitocondriales en la pieza media, y si la ATP producida por los buperos en la pieza media sería capaz de difundirse lo suficientemente rápidamente a lo largo de la longitud del flagelo para apoyar los requisitos energéticos en partes distales de la pieza principal17,18,19. También hay apoyo de un papel para el oxfos en la capacitación de espermatozoides. El oxfos no sólo es más favorable energéticamente que la glucólisis, generando 16 veces más ATP que la glucólisis, sino que el volumen de la pieza media y el contenido mitocondrial están directamente relacionados con la aptitud reproductiva en las especies de mamíferos que presentan mayores grados de competencia entre los machos por las parejas20. Abordar estas preguntas requiere métodos para examinar las contribuciones relativas de la glucólisis y el oxfos durante la capacitación de los espermatozoides.
Tourmente et al. aplicaron un analizador de flujo extracelular de 24 polos para comparar el metabolismo energético de especies de ratones estrechamente relacionadas con parámetros de rendimiento de espermatozoides significativamente diferentes21. En lugar de reportar los valores basales de ECAR y OCR de espermatozoides no capacitados, aquí, adaptamos su método usando un analizador de flujo extracelular de 96 polos para monitorear los cambios en el metabolismo energético durante la capacitación de espermatozoides de ratón en tiempo real. Desarrollamos un método que permite monitorear simultáneamente la glucólisis y el oxfos en tiempo real en esperma con la batida flagelos en hasta doce condiciones experimentales diferentes midiendo el flujo de oxígeno (O2)y protones (H+) (Figura 1A). Debido a la descomposición del piruvato para lactato durante la glucólisis y la producción de CO2 a través del ciclo TCA, los espermatozoides no capacitados y capacitados extruyen H+ en los medios de ensayo que son detectados por el analizador de flujo extracelular a través de fluoróforos sensibles A+-inmovilizados a la punta de la sonda de un cartucho de sensor. Paralelamente, el consumo de O2 por fosforilación oxidativa se detecta a través de fluoróforos sensibles a O2inmovilizados a la misma punta de sonda(Figura 1B). La detección efectiva del H+ liberado y o2 consumido requiere un búfer de espermatozoides modificado con baja capacidad de amortiguación sin bicarbonato o fenol rojo. Por lo tanto, para inducir la capacitación en ausencia de bicarbonato, adoptamos el uso de un campo analógico permeable a la célula inyectado junto con el inhibidor de PDE de amplio rango IBMX22. Tres puertos de inyección independientes adicionales permiten la inyección de activadores farmacológicos y/o inhibidores, lo que facilita la detección en tiempo real de los cambios en la respiración celular y la tasa de glucólisis debido a la manipulación experimental.
Protocol
Representative Results
Discussion
La pérdida de capacitación espermática en ausencia de ciertos sustratos metabólicos o enzimas metabólicas críticas reveló el metabolismo energético como un factor clave que apoya la fertilización exitosa. Un cambio metabólico durante la activación celular es un concepto bien establecido en otros tipos de células, sin embargo, estamos empezando a entender cómo los espermatozoides adaptan su metabolismo a la creciente demanda de energía durante la capacitación. Utilizando un analizador de flujo extracelular,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer el apoyo del Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu en el Rockefeller High Throughput and Spectroscopy Resource Center.
Materials
| Reagents | |||
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A1470 | BSA |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) | Sigma-Aldrich | L7381 | ConA |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 1169567761 | Isoflurane |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3- |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment and materials | |||
| 12 channel pipette 10-100 μL | eppendorf | ES-12-100 | |
| 12 channel pipette 50-300 μL | vwr | 613-5257 | |
| 37 °C, non-CO2 incubator | vwr | 1545 | |
| 5 mL cetrifuge tubes | eppendorf | 30119380 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | vwr | 76211-286 | |
| Centrifuge with plate adapter | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| Dissection kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Inverted phase contrast microscope with 40X objective | Nikon | ||
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided | Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges. |
References
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