באמצעות מנתח השטף של מסחטות כדי למדוד שינויים גליקוליזה ו זירחון חמצוני במהלך הזרע העכבר מדרכיכים
Summary
אנו מתארים את היישום של מנתח השטף של מסחטות כדי לנטר שינויים בזמן אמת ב גליקוליזיס וזרחון חמצוני במהלך מדרכיכים זרע העכבר.
Abstract
הזרע מקבל קיבולת הפריה במערכת הרבייה הנשית בתהליך המכונה מדרכיכים. תהליכים משויכים למדרכיכים דורשים אנרגיה. קיים דיון מתמשך בנוגע למקורות היוצרים את ה-ATP המזין את הזרע לתנועתיות מתקדמת, מדרכיכים, היפרהפעלה ותגובה מאקרומה. כאן, אנו מתארים את היישום של מנתח השטף מחילוץ ככלי לניתוח שינויים בחילוף החומרים של אנרגיה במהלך מדרכיכים זרע העכבר. באמצעות H+-ו O2-רגישות fluorophores, שיטה זו מאפשרת בניטור גליקוליזיס ו זרחון חמצוני בזמן אמת ב-non-capacitated לעומת הזרע קיבול. שימוש בשיטה זו בנוכחות מצעים אנרגטיים שונים ו/או מפעילים פרמקולוגיים ו/או מעכבי יכולים לספק תובנות חשובות לתרומת מסלולים מטבוליים שונים והצטלבות בין איתות מפלי ומטבוליזם במהלך מדרכיכים זרע.
Introduction
היישום של ספקטרומטר המסה יש מהפכה המחקר של חילוף החומרים. ממוקד פרופיל חילוף החומרים והעקיבה metabolomic לאפשר ניטור מדויק של שינויים בחילוף החומרים באנרגיה. עם זאת, ביצוע טבולומיקס בהצלחה דורש הכשרה נרחבת, צוות מנוסה, ו יקר, ספקטרומטר מסה מאוד רגיש לא זמין לכל מעבדה. בשנים האחרונות, באמצעות מנתח השטף של מסחטות, כגון סוסון ים XFe96 גדל פופולרי כשיטה פונדקאית למדידת שינויים בחילוף החומרים של אנרגיה בסוגי תאים שונים1,2,3,4,5.
זרע הם תאים מיוחדים מאוד משבצת; אשר משימתו היא לספק את הגנום אבהי כדי oocyte. זרע עוזב את מערכת הרבייה זכר לאחר שפיכה הם עדיין בלתי בוגרים מבחינה פונקציונלית ולא ניתן להפרות את oocyte כי הם לא מסוגלים לחדור את הvestments של oocytes. זרע לרכוש יכולת דישון כאשר הם עוברים דרך מערכת הרבייה הנשית בתהליך התבגרות המכונה מדרכיכים6,7. הפליטה הטרייה של זרע או זרע בגזור מיותרת הזנב יכול להיות capacitated בחוץ על ידי דגירה באמצעות המדרכיכים מדיה מוגדר המכיל Ca2 +, ביקרבונט (hco3–) או מחנה חדיר תאים אנלוגי (למשל, diבוטילטור-מחנה), קבלה כולסטרול (למשל, סרום בשור, bsa), ומקור אנרגיה (למשל, גלוקוז). במהלך המדרכיכים, זרע לשנות את דפוס התנועתיות שלהם לתוך להכות המרצפות אסימטריים, המייצג מצב שחייה שנקרא hyperactivation פעלה8,9, והם הופכים להיות מוכשרים כדי לעבור את התגובה האקרוכמה7, שם אנזימים פרוטבחרדה שפורסמו כי לעכל את הבאויות של oocytes. תהליכים אלה דורשים אנרגיה, ובדומה לתאים סומטיים, זרע לייצר ATP ותרכובות אנרגיה גבוהות אחרות דרך גליקוליזיס, כמו גם מחזור TCA מיטוכונדריאלי וזירחון חמצוני (oxphos)10. בעוד מחקרים מרובים מדגימים כי גליקוליזיס הוא הכרחי ומספיק כדי לתמוך זרע מדרכיכים11,12,13,14, התרומה של oxphos הוא פחות ברור. בניגוד לסוגי תאים אחרים בהם גליקולזיס משולב פיזית למחזור ה-tca, הזרע ממדר מאוד ונחשבים לשמור על תהליכים אלה בתאי הריצוף הנפרדים: המיחלק מתמקד במכונות המייטוכונדריאלי, בעוד שהאנזימים המרכזיים של גליקוליזה מופיעים כמוגבלים לחלק העיקרי15,16. מידור זה מביא לויכוח מתמשך על האם פירובט המיוצר בחלק העיקרי מאת גליקולזיס יכול לתמוך באוקפוס מיטוכונדריאלי באמצע החלק, והאם ATP המיוצר על ידי oxphos ב-midpiece יוכל לפזר במהירות מספקת לאורך הפלאללום כדי לתמוך בדרישות האנרגיה בחלקים העיקריים של החלק העיקרי של הקרן17,18,19. יש גם תמיכה של תפקיד של oxphos במדרכיכים זרע. לא רק האוקפוס יותר מאשר באופן אנרגטי יותר מאשר גליקוליזיס, היוצר פי 16 יותר ATP מאשר גליקוליזיס, אך מידות נפח ותוכן מיטוכונדריאלי מתואמים במישרין עם כושר הרבייה במינים היונקים המוצגים דרגות גדולות יותר של התחרות בין הזכרים לחבריםבגיל 20. התייחסות לשאלות אלה מחייבת שיטות לבדיקת התרומות היחסיות של גליקוליזיס ואוקפוס במהלך מדרכיכים זרע.
Tourmente ואח ‘ להחיל מנתח השטף היטב של ממרור כדי להשוות את חילוף החומרים של האנרגיה של מינים העכבר קשור היטב עם פרמטרים שונים באופן משמעותי ביצועי זרע21. במקום לדווח על הערכים ECAR בסיס ו-OCR של זרע non-capacitated, כאן, אנו להתאים את השיטה שלהם באמצעות 96-היטב מנתח השטף לעקוב אחר שינויים בחילוף החומרים של אנרגיה במהלך זרע העכבר מדרכיכים בזמן אמת. פיתחנו שיטה המאפשרת במקביל לניטור גליקוליזיס ו oxphos בזמן אמת בזרע עם הכאת הדגל של עד 12 מצבים ניסיוניים שונים על ידי מדידת שטף של חמצן (O2) ו פרוטונים (H+) (איור 1a). בשל פירוק של פירובט כדי לקטט במהלך גליקוליזיס וייצור של CO2 באמצעות tca-מחזור, non-capacitated ו capacitated זרע הבלטה+ לתוך מדיה היכולת אשר מזוהים על ידי מנתח השטף החילוץ באמצעות H+-רגיש fluorophores לקצה בדיקה של מחסנית חיישן. במקביל, O2 הצריכה על ידי זרחון חמצוני מזוהה באמצעות fluorophores2-רגיש לקיבוע לאותו קצה בדיקה (איור 1b). זיהוי אפקטיבי של H+ ו נצרך O2 דורש מאגר זרע שונה עם קיבולת אגירה נמוכה ללא ביקרבונט או פנול אדום. כך, כדי לגרום מדרכיכים בהעדר ביקרבונט, אימצנו את השימוש במחנה חדיר מחנה אנלוגי מוזרק יחד עם טווח רחב PDE מעכבי IBMX22. שלוש יציאות הזרקה עצמאיות נוספות מאפשרות הזרקה של מפעילים פרמקולוגיים ו/או מעכבי, אשר מקלה על זיהוי בזמן אמת של שינויים בנשימה התאית ובקצב גליקוליזיס עקב טיפול ניסיוני.
Protocol
Representative Results
Discussion
אובדן של זרע מדרכיכים בהיעדר מצעים מטבולית מסוימים או אנזימים מטבולית קריטיים חשף את חילוף החומרים של האנרגיה כגורם מפתח התומך הפריה מוצלחת. מתג מטבולית במהלך הפעלת התא הוא מושג היטב בסוגי תאים אחרים, עם זאת, אנחנו רק מתחילים להבין איך זרע להתאים את חילוף החומרים שלהם לביקוש האנרגיה הגובר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להכיר בתמיכתם של ד ר לוטו ראמוס-אגריטו במרכז המשאבים של התפוקה והספקטרוסקופיה ברוקפלר.
Materials
| Reagents | |||
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A1470 | BSA |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) | Sigma-Aldrich | L7381 | ConA |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 1169567761 | Isoflurane |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3- |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment and materials | |||
| 12 channel pipette 10-100 μL | eppendorf | ES-12-100 | |
| 12 channel pipette 50-300 μL | vwr | 613-5257 | |
| 37 °C, non-CO2 incubator | vwr | 1545 | |
| 5 mL cetrifuge tubes | eppendorf | 30119380 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | vwr | 76211-286 | |
| Centrifuge with plate adapter | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| Dissection kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Inverted phase contrast microscope with 40X objective | Nikon | ||
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided | Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges. |
References
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T. Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).
- Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).
- de Groof, A. J., et al. Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype. Molecular Cancer. 8, 54 (2009).
- Chao, L. C., et al. Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77. Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).
- Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).
- Austin, C. R., Bishop, M. W. Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).
- Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).
- Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
- Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O’Brien, D. A. Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation. Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose. Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).
- Danshina, P. V., et al. Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice. Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).
- Miki, K., et al. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).
- Mori, C., et al. Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail. Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).
- Westhoff, D., Kamp, G. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa. Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).
- Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. Diffusion of ATP in sperm flagella. Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).
- Adam, D. E., Wei, J. Mass transport of ATP within the motile sperm. Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).
- Tombes, R. M., Shapiro, B. M. Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).
- Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size. Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).
- Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species. Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).
- Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).
- Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals. PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).
- Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).
- Morgan, D. J., et al. Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation. PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).
