Brug caenorhabditis elegans til skærmen for vævsspecifikke chaperone interaktioner

Summary

For at studere chaperone-chaperone og chaperone-substrat interaktioner, udfører vi syntetiske interaktion skærme i Caenorhabditis elegans ved hjælp af RNA interferens i kombination med milde mutationer eller over-udtryk for chaperoner og overvåge vævsspecifikke protein dysfunktion på organismeniveau.

Abstract

Korrekt foldning og samling af proteiner og proteinkomplekser er afgørende for cellulær funktion. Celler anvender kvalitetskontrolveje, der korrigerer, afholder eller eliminerer beskadigede proteiner for at opretholde et sundt proteom, hvilket sikrer cellulære proteostase og forhindrer yderligere proteinskader. På grund af overflødige funktioner inden for proteostase netværk, screening for påviselige fænotyper ved hjælp af knockdown eller mutationer i chaperone-kodning gener i multicellulære organisme Caenorhabditis elegans resulterer i påvisning af mindre eller ingen fænotyper i de fleste tilfælde. Vi har udviklet en målrettet screeningsstrategi for at identificere chaperoner, der kræves til en bestemt funktion og dermed bygge bro mellem fænotype og funktion. Specifikt overvåger vi nye chaperone interaktioner ved hjælp af RNAi syntetiske interaktion skærme, banke-down chaperone udtryk, en anstandsdame ad gangen, i dyr, der bærer en mutation i en anstandsdame-kodning gen eller over-udtrykke en anstandsdame af interesse. Ved at forstyrre to chaperoner, der individuelt præsenterer ingen brutto fænotype, kan vi identificere chaperoner, der forværrer eller udsætter en bestemt fænotype, når begge forstyrres. Vi viser, at denne tilgang kan identificere specifikke sæt chaperoner, der fungerer sammen for at modulere foldningen af et protein- eller proteinkomplekser forbundet med en given fænotype.

Introduction

Celler klare proteinskader ved at anvende kvalitetskontrol machineries at reparere, binde eller fjerne eventuelle beskadigede proteiner^1,2. Foldning og samling af proteinkomplekser understøttes af molekylære chaperoner, en forskelligartet gruppe af meget konserverede proteiner, der kan reparere eller binde beskadigede proteiner^3,4,5,6,7. Fjernelsen af beskadigede proteiner medieres af ubiquitin-proteasome-systemet (UPS)⁸ eller af autophagy-maskinerne⁹ i samarbejde med chaperoner^10,11,12. Protein homøostase (proteostase) vedligeholdes derfor af kvalitetskontrolnetværk, der består af folde- og nedbrydningsmaskiner^3,13. Det er imidlertid en stor udfordring at forstå samspillet mellem de forskellige komponenter i proteostasenetværket in vivo. Mens protein-protein interaktion skærme bidrage med vigtige oplysninger om fysiske interaktioner og chaperone komplekser^14,15, forståelse af organisation og kompenserende mekanismer inden for vævsspecifikke chaperone netværk in vivo mangler.

Genetiske interaktioner bruges ofte som et kraftfuldt værktøj til at undersøge forholdet mellem par af gener, der er involveret i fælles eller kompenserende biologiske veje^16,17,18. Sådanne relationer kan måles ved at kombinere par mutationer og kvantificere virkningen af en mutation i et gen på den fænotypiske sværhedsgrad forårsaget af en mutation i det andet gen¹⁶. Mens de fleste sådanne kombinationer ikke viser nogen effekt i form af fænotype, nogle genetiske interaktioner kan enten forværre eller lindre sværhedsgraden af den målte fænotype. Skærpende mutationer observeres, når fænotypen af dobbelt sletning mutant er mere alvorlig end den forventede fænotype set ved at kombinere enkelt sletning mutanter, hvilket indebærer, at de to gener fungerer i parallelle veje, sammen påvirker en given funktion. I modsætning hertil observeres lindre mutationer, når fænotypen af dobbelt sletning mutant er mindre alvorlig end fænotypen set med enkelt sletning mutanter, hvilket indebærer, at de to gener fungerer sammen som et kompleks eller deltage i den samme vej^16,18. Derfor er forskellige fænotyper, der kan kvantificeres, herunder brede fænotyper, såsom dødelighed, vækstrater og brødstørrelse, samt specifikke fænotyper, såsom transskriptionelle journalister, blevet brugt til at identificere genetiske interaktioner. For eksempel, Jonikas et al. påberåbt sig en ER stress reporter til at undersøge interaktioner af Saccharomyces cerevisiae ER udfoldet protein respons proteostase netværk ved hjælp af parvis gensletning analyser¹⁹.

Genetiske interaktion skærme indebærer systematisk krydser parvis sletning mutationer til at generere et omfattende sæt af dobbelt mutanter²⁰. Men i dyremodeller, og specifikt i C. elegans,er denne store tilgang ikke mulig. I stedet kan mutantstammer testes for deres genetiske interaktionsmønstre ved at nedregulerende genekspression ved hjælp af RNA-interferens (RNAi)²¹. C. elegans er et kraftfuldt system til skærme baseret på RNAi^22,23. I C. elegansopnås dobbeltstrenget RNA (dsRNA) levering ved bakteriel fodring, hvilket fører til spredning af dsRNA-molekyler til mange væv. På denne måde påvirker de indførte dsRNA-molekyler dyret via en hurtig og enkel procedure²¹. En genetisk interaktion skærm ved hjælp af RNAi kan derfor afsløre virkningen af ned-regulering af et sæt af gener eller de fleste C. elegans kodning gener ved hjælp af RNAi biblioteker²⁴. I en sådan skærm, hits, der påvirker adfærd mutant af interesse, men ikke den vilde type stamme er potentielle modifikatorer af fænotypen overvåges²⁵. Her anvender vi en kombination af mutationer og RNAi screening til systematisk at kortlægge vævsspecifikke chaperoneinteraktioner i C. elegans.

Protocol

1. Forberedelse af nematode vækst medieplader til RNAi Til en 1 L flaske, tilsæt 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Peptone, 17 g agar og destilleret vand op til 1 L og autoklave. Kølig flaske til 55 °C. Tilsæt 25 mL af 1 M KH2PO4, pH 6,0, 1 mL af 1 M CaCl2,1 mL på 1 M MgSO4og 1 mL kolesterolopløsning (tabel 1) for at lave nematode vækstmedier (NGM). Der tilsættes 1 mL ampicillin (100 mg/mL) og 0,5 mL 1 M IPTG (tabel …

Representative Results

Brug af temperaturfølsomme mutationer i UNC-45 til at screene for at forværre eller lindre interaktioner under henholdsvis eftergivende eller restriktive forholdMuskel samling og vedligeholdelse tilbyder et effektivt system til at studere vævsspecifikke chaperone interaktioner. Den funktionelle enhed af kontraktile muskler, sarkomen, præsenterer en krystallinsk-lignende arrangement af strukturelle og lovgivningsmæssige proteiner. Stabiliteten af motorprotein myosin og dets indarbejdelse i de tyk…

Discussion

Et integreret billede af proteostasenetværket, der afspejler, hvordan det er organiseret og fungerer i forskellige metazoceller og væv, mangler stadig. For at løse denne mangel kræves der specifikke oplysninger om samspillet mellem forskellige komponenter i dette netværk, såsom molekylære chaperoner, i specifikke væv i løbet af udvikling og aldring. Her viste vi, hvordan brugen af vævsspecifikke forstyrrelser gjorde det muligt for os at undersøge chaperonenetværket i et givet væv. For at udforske vævsspecif…

Materials

12-well-plates	SPL	BA3D16B
40 mm plates	Greiner Bio-one	627160
60 mm plates	Greiner Bio-one	628102
6-well plates	Thermo Scientific	140675
96 well 2 mL 128.0/85mm	Greiner Bio-one	780278
Agar	Formedium	AGA03
Ampicillin	Formedium	69-52-3
bromophenol blue	Sigma	BO126-25G
CaCl2	Merck	1.02382.0500
Camera	Qimaging	q30548
Cholesterol	Amresco	0433-250G
Confocal	Leica	DM5500
Filter (0.22 µm)	Sigma	SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope	Leica	MZ165FC
Glycerol	Frutarom	2355519000024
IPTG	Formedium	367-93-1
KCl	Merck	104936
KH2PO4	Merck	1.04873.1000
KOH	Bio-Lab	001649029100
MgSO4	Fisher	22189-08-8	Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody	Hybridoma Bank	5-6
Na2HPO4·7H2O	Sigma	s-0751
NaCl	Bio-Lab	001903029100
Peptone	Merck	61930705001730
Plate pouring pump	Integra	does it p920
RNAi Chaperone library	NA	NA
SDS	VWR Life Science	0837-500
ß-mercaptoethanol	Bio world	41300000-1
stereomicroscope	Leica	MZ6
Tetracycline	Duchefa Biochemie	64-75-5
Tris	Bio-Lab	002009239100
Tween-20	Fisher	BP337-500