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Biology

カエノハブディティス・エレガンスを使用して組織特異的シャペロン相互作用をスクリーニングする

Published: June 07, 2020
doi:
10.3791/61140
, , ,
1Department of Life Sciences,Ben-Gurion University of the Negev

Summary

シャペロン-シャペロンとシャペロン基質相互作用を研究するために、我々は、軽度の突然変異またはシャペロンの過剰発現と組み合わせてRNA干渉を使用して カエノハブディティス・エレガンス の合成相互作用スクリーンを行い、組織レベルで組織特異的タンパク質機能不全を監視する。

Abstract

細胞機能には、タンパク質およびタンパク質複合体の正しい折り畳みと組み立てが不可欠です。細胞は、損傷したタンパク質を正し、隔離し、または排除する品質管理経路を採用して、健康なプロテオームを維持し、細胞プロテオスタシスを確保し、さらなるタンパク質損傷を防ぎます。プロテオスタシスネットワーク内の冗長な機能のため、多細胞生物 カエノルハブディティス・エレガン スにおけるノックダウンまたはシャペロンコード遺伝子の変異を用いて検出可能な表現型のスクリーニングは、ほとんどの場合、マイナーまたは全く表現型の検出をもたらす。特定の機能に必要なシャペロンを同定し、表現型と機能のギャップを埋める目的でスクリーニング戦略を策定しました。具体的には、RNAi合成相互作用スクリーンを用いた新規シャペロン相互作用、ノックダウンシャペロン発現、一度に1つのシャペロン発現、シャペロンコード遺伝子の変異を運ぶ動物、または目的のシャペロンを過剰発現する動物を監視する。個々にグロス表現型を呈しない2つのシャペロンを破壊することによって、我々は両方が摂動したときに特定の表現型を悪化させるか、または暴露するシャペロンを同定することができる。我々は、このアプローチが、特定の表現型に関連するタンパク質またはタンパク質複合体の折り畳みを調節するために一緒に機能するシャペロンの特定のセットを同定できることを実証する。

Introduction

細胞は、損傷したタンパク質1,2を修復、隔離、除去する品質管理機械を採用することで、タンパク質の損傷に対処する。タンパク質複合体の折りたたみおよび組立は、分子シャペロンによって支持され、損傷したタンパク質3、4、5、6、7を修復または隔離することができる高度に保存されたタンパク質の多様なグループである。損傷したタンパク質の除去は、ユビキチンプロテアソーム系(UPS)8またはオートファジー機械9によってシャペロン10、11、12との協調で媒介される。タンパク質ホメオスタシス(プロテオスタシス)は、従って、折りたたみおよび分解機3,13からなる品質管理ネットワークによって維持される。しかし、生体内のプロテオスタシスネットワークの様々な成分間の相互作用を理解することは大きな課題です。タンパク質とタンパク質の相互作用スクリーンは、物理的相互作用とシャペロン複合体14,15に関する重要な情報を提供する一方で、生体内の組織特異的シャペロンネットワーク内の組織および補償機構を理解することは欠けている。

遺伝的相互作用は、一般的なまたは代償的な生物学的経路16、17、18に関与する遺伝子のペア間の関係を調べるための強力なツールとしてしばしば使用される。このような関係は、2番目の遺伝子16の突然変異によって引き起こされる表向きの重症度に対する1つの遺伝子における突然変異の一対を組み合わせることによって測定することができる。そのような組み合わせのほとんどは表現型の面で効果を示さないが、いくつかの遺伝的相互作用は、測定された表現型の重症度を悪化させるか、または緩和することができる。二重欠失変異体の表現型が単一欠失変異体を組み合わせた際に見られる予想より重篤な場合に、悪化する変異が観察され、2つの遺伝子が並列経路で機能し、一緒に特定の機能に影響を与える。これに対し、二重欠失変異体の表現型が単一欠失変異体に見られる表現型よりも重症でない場合に緩和突然変異が観察され、2つの遺伝子が複合体として作用するか、あるいは同じ経路16,18に関与することを示唆する。したがって、致死性、増殖速度およびブロードサイズなどの広範な表現型、ならびに転写レポーターなどの特定の表現型を含む、定量化できる多様な表現型が、遺伝的相互作用を同定するために使用されてきた。例えば、Jonikasらの研究は、ペアワイズ遺伝子欠失解析を用いて、サッカロマイセスCErevisiae ER展開タンパク質応答プロテオスタシスネットワークの相互作用を調べるためにERストレスレポーターに依存していた19。

遺伝的相互作用画面は、二重変異体20の包括的なセットを生成するために体系的にペアワイズ欠失突然変異を交差することを含む。しかし、動物モデル、特にC.エレガンスでは、この大規模なアプローチは実現不可能です。代わりに、変異株は、RNA干渉(RNAi)21を用いて遺伝子発現を下方調節することによって、それらの遺伝的相互作用パターンについて試験することができる。C. エレガンスは RNAi22、23に基づくスクリーンのための強力なシステムです。C.エレガンスでは、二本鎖RNA(dsRNA)の送達は細菌の供給によって達成され、dsRNA分子が多数の組織に広がった。このようにして、導入されたdsRNA分子は、迅速かつ簡単な手順21を介して動物に影響を与える。したがって、RNAiを用いた遺伝的相互作用スクリーンは、RNAiライブラリ24を用いて遺伝子またはほとんどのC.エレガンスコード遺伝子の一組をダウンレギュリングすることの影響を明らかにすることができる。このような画面では、対象の変異体の挙動に影響を与えるが、野生型株は影響しないヒットは、監視されている表現型の潜在的な修飾子である25.ここでは、変異とRNAiスクリーニングの組み合わせを適用して、C.エレガンスにおける組織特異的シャペロン相互作用を体系的にマッピングする。

Protocol

1. RNAi用線虫増殖培地プレートの製造 1 Lボトルに、NaClの3g、バクトペプトンの2.5g、寒天17g、蒸留水1Lとオートクレーブを加えます。 55°Cに冷却ボトル。 25 mLの1 M KH2PO4、pH6.0、1 M CaCl2の1 mL、1 M MgSO4の1 mL、コレステロール溶液1 mL(表1)を加え、線虫増殖培地(NGM)を作る。 1 mL のアンピシリン (100 mg/mL) と 0.5 mL の 1 M IPTG (<stro…

Representative Results

UNC-45の温度感受性変異を使用して、許容的または制限的な条件下での相互作用を悪化または緩和するためのスクリーニング筋肉のアセンブリとメンテナンスは、組織特異的なシャペロン相互作用を研究する効果的なシステムを提供します。収縮性筋肉の機能的単位であるサルコメアは、構造タンパク質と調節タンパク質の結晶状の配置を示す。運動タンパク質ミオシンの安定?…

Discussion

プロテオスタシスネットワークの統合画像は、それがどのように組織化され、異なるメタゾアン細胞および組織で機能するかを反映しています。この欠点に対処するためには、開発や老化の過程で、分子シャペロンなどのこのネットワークの様々な構成要素の相互作用に関する具体的な情報が必要です。ここでは、組織特異的摂動を使用して、特定の組織におけるシャペロンネットワークを?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、線虫株の一部のために、NIH国立研究資源センター(NCRR)が資金を提供するカエネルハブディティス遺伝学センターに感謝します。H.F. エプスタインによって開発されたモノクローナル抗体は、NICHDの後援の下で開発され、アイオワ大学生物学部によって維持された開発研究ハイブリドーマ銀行から得られました。本研究は、イスラエル科学財団(278/18)、イスラエル科学技術省、外務省、イタリア共和国国振興総局(助成金第3-14337)からの助成金によって支援されました。この原稿の作成に協力を寄せられるよう、Ben-Zvi研究室のメンバーに感謝します。

Materials

12-well-plates SPL BA3D16B
40 mm plates Greiner Bio-one 627160
60 mm plates Greiner Bio-one 628102
6-well plates Thermo Scientific 140675
96 well 2 mL 128.0/85mm Greiner Bio-one 780278
Agar Formedium AGA03
Ampicillin Formedium 69-52-3
bromophenol blue Sigma BO126-25G
CaCl2 Merck 1.02382.0500
Camera Qimaging q30548
Cholesterol Amresco 0433-250G
Confocal Leica DM5500
Filter (0.22 µm) Sigma SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope Leica MZ165FC
Glycerol Frutarom 2355519000024
IPTG Formedium 367-93-1
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 1.04873.1000
KOH Bio-Lab 001649029100
MgSO4 Fisher 22189-08-8 Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody Hybridoma Bank 5-6
Na2HPO4·7H2O Sigma s-0751
NaCl Bio-Lab 001903029100
Peptone Merck 61930705001730
Plate pouring pump Integra does it p920
RNAi Chaperone library NA NA
SDS VWR Life Science 0837-500
ß-mercaptoethanol Bio world 41300000-1
stereomicroscope Leica MZ6
Tetracycline Duchefa Biochemie 64-75-5
Tris Bio-Lab 002009239100
Tween-20 Fisher BP337-500
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Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions. J. Vis. Exp. (160), e61140, doi:10.3791/61140 (2020).
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