Om chaperonne-chaperonne- en chaperonne-substraatinteracties te bestuderen, voeren we synthetische interactiescreenings uit in Caenorhabditis elegans met behulp van RNA-interferentie in combinatie met milde mutaties of overexpressie van chaperonnes en monitoren we weefselspecifieke eiwitdisfunctie op organismaal niveau.
Correcte vouwing en assemblage van eiwitten en eiwitcomplexen zijn essentieel voor de cellulaire functie. Cellen maken gebruik van kwaliteitscontroleroutes die beschadigde eiwitten corrigeren, sequesteren of elimineren om een gezond proteoom te behouden, waardoor cellulaire proteostase wordt gewaarborgd en verdere eiwitschade wordt voorkomen. Vanwege redundante functies binnen het proteostasenetwerk resulteert screening op detecteerbare fenotypes met behulp van knockdown of mutaties in chaperonne-coderende genen in het meercellige organisme Caenorhabditis elegans in de meeste gevallen in de detectie van kleine of geen fenotypen. We hebben een gerichte screeningsstrategie ontwikkeld om chaperones te identificeren die nodig zijn voor een specifieke functie en zo de kloof tussen fenotype en functie te overbruggen. In het bijzonder monitoren we nieuwe chaperonne-interacties met behulp van synthetische interactieschermen van RNAi, knock-down chaperone-expressie, één chaperone tegelijk, bij dieren die een mutatie dragen in een chaperonne-coderend gen of een chaperonne van belang overexpressie. Door twee chaperones te verstoren die individueel geen grof fenotype vertonen, kunnen we chaperones identificeren die een specifiek fenotype verergeren of blootleggen wanneer beide verstoord zijn. We tonen aan dat deze benadering specifieke sets chaperones kan identificeren die samen functioneren om de vouwing van een eiwit of eiwitcomplexen geassocieerd met een bepaald fenotype te moduleren.
Cellen gaan om met eiwitschade door gebruik te maken van kwaliteitscontrolemachines die beschadigde eiwitten repareren, opsnijven of verwijderen1,2. Vouwen en assembleren van eiwitcomplexen worden ondersteund door moleculaire chaperonnes, een diverse groep van sterk geconserveerde eiwitten die beschadigde eiwitten kunnen herstellen of afslinden3,4,5,6,7. De verwijdering van beschadigde eiwitten wordt gemedieerd door het ubiquitine-proteasoomsysteem (UPS)8 of door de autofagiemachines9 in samenwerking met chaperones10,11,12. Eiwithomeostase (proteostase) wordt daarom in stand gehouden door kwaliteitscontrolenetwerken die bestaan uit vouw- en afbraakmachines3,13. Het begrijpen van de interacties tussen de verschillende componenten van het proteostasenetwerk in vivo is echter een grote uitdaging. Hoewel eiwit-eiwitinteractieschermen belangrijke informatie bijdragen over fysieke interacties en chaperonnecomplexen14,15, ontbreekt het aan inzicht in de organisatie en compensatiemechanismen binnen weefselspecifieke chaperonnenetwerken in vivo.
Genetische interacties worden vaak gebruikt als een krachtig hulpmiddel om de relatie te onderzoeken tussen paren van genen die betrokken zijn bij gemeenschappelijke of compenserende biologische routes16,17,18. Dergelijke relaties kunnen worden gemeten door paren van mutaties te combineren en de impact van een mutatie in één gen op de fenotypische ernst veroorzaakt door een mutatie in het tweede gen te kwantificeren16. Hoewel de meeste van dergelijke combinaties geen effect hebben in termen van fenotype, kunnen sommige genetische interacties de ernst van het gemeten fenotype verergeren of verlichten. Verergerende mutaties worden waargenomen wanneer het fenotype van de dubbele deletiemutant ernstiger is dan het verwachte fenotype dat wordt gezien bij het combineren van de mutanten met enkele deletie, wat impliceert dat de twee genen in parallelle routes functioneren, samen een bepaalde functie beïnvloeden. Daarentegen worden verlichtende mutaties waargenomen wanneer het fenotype van de dubbele deletiemutant minder ernstig is dan het fenotype dat wordt gezien met de mutanten met enkele deletie, wat impliceert dat de twee genen samen als een complex werken of deelnemen aan dezelfde route16,18. Dienovereenkomstig zijn diverse fenotypen die kunnen worden gekwantificeerd, waaronder brede fenotypen, zoals letaliteit, groeisnelheden en broedgrootte, evenals specifieke fenotypen, zoals transcriptionele verslaggevers, gebruikt om genetische interacties te identificeren. Jonikas et al. vertrouwden bijvoorbeeld op een ER-stressverslaggever om interacties van het Saccharomyces cerevisiae ER ontvouwde eiwitresponsproteostase-netwerk te onderzoeken met behulp van paarsgewijze gendeletieanalyses19.
Genetische interactieschermen omvatten het systematisch kruisen van paarsgewijze deletiemutaties om een uitgebreide set dubbele mutanten te genereren20. In diermodellen, en specifiek in C. elegans, is deze grootschalige aanpak echter niet haalbaar. In plaats daarvan kunnen gemuteerde stammen worden getest op hun genetische interactiepatronen door genexpressie te downreguleren met behulp van RNA-interferentie (RNAi)21. C. elegans is een krachtig systeem voor schermen op basis van RNAi22,23. In C. eleganswordt dubbelstrengs RNA (dsRNA) levering bereikt door bacteriële voeding, wat leidt tot de verspreiding van dsRNA-moleculen naar talrijke weefsels. Op deze manier beïnvloeden de geïntroduceerde dsRNA-moleculen het dier via een snelle en eenvoudige procedure21. Een genetische interactiescreening met behulp van RNAi kan daarom de impact onthullen van het downreguleren van een set genen of de meeste C. elegans-coderende genen met behulp van RNAi-bibliotheken24. In zo’n scherm zijn hits die van invloed zijn op het gedrag van de mutant van belang, maar niet de wildtype stam potentiële modifiers van het fenotype die worden gecontroleerd25. Hier passen we een combinatie van mutaties en RNAi-screening toe om systematisch weefselspecifieke chaperonne-interacties in C. elegansin kaart te brengen.
Een geïntegreerd beeld van het proteostasenetwerk dat weerspiegelt hoe het is georganiseerd en functioneert in verschillende metazoïsche cellen en weefsels ontbreekt nog steeds. Om deze tekortkoming aan te pakken, is specifieke informatie nodig over de interacties van verschillende componenten van dit netwerk, zoals moleculaire chaperones, in specifieke weefsels in de loop van ontwikkeling en veroudering. Hier lieten we zien hoe het gebruik van weefselspecifieke verstoringen ons in staat stelde om het chaperonnenetwerk…
The authors have nothing to disclose.
We danken het Caenorhabditis Genetics Center, gefinancierd door het NIH National Center for Research Resources (NCRR), voor enkele van de nematodenstammen. Monoklonale antilichamen ontwikkeld door H.F. Epstein werden verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD en onderhouden door de afdeling Biologie, Universiteit van Iowa. Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van de Israel Science Foundation (subsidie nr. 278/18) en door een subsidie van het Israëlische ministerie van Wetenschap en Technologie, en het ministerie van Buitenlandse Zaken en Internationale Samenwerking, directoraat-generaal voor landenbevordering, Italiaanse Republiek (subsidie nr. 3-14337). We bedanken leden van het Ben-Zvi laboratorium voor hulp bij het voorbereiden van dit manuscript.
12-well-plates | SPL | BA3D16B | |
40 mm plates | Greiner Bio-one | 627160 | |
60 mm plates | Greiner Bio-one | 628102 | |
6-well plates | Thermo Scientific | 140675 | |
96 well 2 mL 128.0/85mm | Greiner Bio-one | 780278 | |
Agar | Formedium | AGA03 | |
Ampicillin | Formedium | 69-52-3 | |
bromophenol blue | Sigma | BO126-25G | |
CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | |
Camera | Qimaging | q30548 | |
Cholesterol | Amresco | 0433-250G | |
Confocal | Leica | DM5500 | |
Filter (0.22 µm) | Sigma | SCGPUO2RE | |
Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ165FC | |
Glycerol | Frutarom | 2355519000024 | |
IPTG | Formedium | 367-93-1 | |
KCl | Merck | 104936 | |
KH2PO4 | Merck | 1.04873.1000 | |
KOH | Bio-Lab | 001649029100 | |
MgSO4 | Fisher | 22189-08-8 | Gift from the Morimoto laboratory |
Myosin MHC A (MYO-3) antibody | Hybridoma Bank | 5-6 | |
Na2HPO4·7H2O | Sigma | s-0751 | |
NaCl | Bio-Lab | 001903029100 | |
Peptone | Merck | 61930705001730 | |
Plate pouring pump | Integra | does it p920 | |
RNAi Chaperone library | NA | NA | |
SDS | VWR Life Science | 0837-500 | |
ß-mercaptoethanol | Bio world | 41300000-1 | |
stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
Tetracycline | Duchefa Biochemie | 64-75-5 | |
Tris | Bio-Lab | 002009239100 | |
Tween-20 | Fisher | BP337-500 |