JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

Published: June 07, 2020
doi:
10.3791/61140
, , ,
1Department of Life Sciences,Ben-Gurion University of the Negev

Summary

Refakatçi-refakatçi ve refakatçi-substrat etkileşimlerini incelemek için, hafif mutasyonlar veya refakatçilerin aşırı ekspresyumu ile birlikte RNA paraziti kullanarak Caenorhabditis elegans’ta sentetik etkileşim ekranları gerçekleştiriyoruz ve dokuya özgü protein disfonksiyonunu organizma düzeyinde izliyoruz.

Abstract

Hücresel fonksiyon için proteinlerin ve protein komplekslerinin doğru katlanır ve montajı esastır. Hücreler, sağlıklı bir proteom sağlamak için hasarlı proteinleri düzelten, inzup tutan veya ortadan kaldıran kalite kontrol yollarını kullanır, böylece hücresel proteostaz sağlar ve daha fazla protein hasarını önler. Proteostaz ağı içindeki gereksiz işlevler nedeniyle, çok hücreli organizma Caenorhabditis elegans’ta refakatçi kodlayıcı genlerde nakavt veya mutasyonlar kullanılarak tespit edilebilir fenotiplerin taranması, çoğu durumda küçük veya hiç fenotip tespit edilmesiyle sonuçlanır. Belirli bir işlev için gerekli olan refakatçileri belirlemek ve böylece fenotip ile işlev arasındaki boşluğu kapatmak için hedefli bir tarama stratejisi geliştirdik. Özellikle, refakatçi kodlayan gende mutasyon taşıyan veya bir ilgi refakatçisini aşırı ifade eden hayvanlarda RNAi sentetik etkileşim ekranlarını, yıkıcı refakatçi ifadesini, her seferinde bir refakatçiyi kullanarak yeni refakatçi etkileşimlerini izliyoruz. Bireysel olarak brüt fenotip sunmayan iki refakatçiyi bozarak, her ikisi de rahatsız edildiğinde belirli bir fenotipi ağırleştiren veya açığa çıkaran refakatçileri tanımlayabiliriz. Bu yaklaşımın, belirli bir fenotiple ilişkili bir protein veya protein komplekslerinin katlamasını modüle etmek için birlikte çalışan belirli refakatçi kümelerini tanımlayabileceğini gösteriyoruz.

Introduction

Hücreler, hasarlı proteinleri onaran, inzdiye alan veya uzaklaştıran kalite kontrol makineleri kullanarak protein hasarı ile başa çıkar1,2. Protein komplekslerinin katlanır ve montajı moleküler refakatçiler tarafından desteklenir, hasarlı proteinleri onarabilen veya inzal ettirebilen çok korunmuş proteinlerden oluşan çeşitli bir grup 3 ,4,5,6,7. Hasarlı proteinlerin uzaklaştırılması, ubiquitin-proteazom sistemi (UPS)8 veya10, 11, 12refakatçileri ile işbirliği içinde otofaji makineleri9 tarafındanaracılıkedilir. Protein homeostaz (proteostaz) bu nedenle, katlama ve bozulma makinelerinden oluşan kalite kontrol ağları tarafından sürdürülmektedir3,13. Bununla birlikte, proteostaz ağının çeşitli bileşenleri arasındaki etkileşimleri anlamak büyük bir zorluktur. Protein-protein etkileşim ekranları fiziksel etkileşimler ve refakat kompleksleri hakkında önemli bilgilere katkıda bulunurken14,15, organizasyonu anlamak ve dokuya özgü refakatçi ağları içindeki telafi edici mekanizmalar in vivo eksiktir.

Genetik etkileşimler genellikle ortak veya telafi edici biyolojik yollarda yer alan gen çiftleri arasındaki ilişkiyi incelemek için güçlü bir araç olarak kullanılır16,17,18. Bu tür ilişkiler, mutasyon çiftlerinin birleştirilmesi ve bir gendeki bir mutasyonun ikinci gendeki bir mutasyonun neden olduğu fenotipik şiddet üzerindeki etkisinin ölçülmesi ile ölçülebilir16. Bu kombinasyonların çoğu fenotip açısından herhangi bir etki göstermese de, bazı genetik etkileşimler ölçülen fenotipin şiddetini ağırlaştırabilir veya hafifletebilir. Çift silme mutantının fenotipi, tek silme mutantlarının birleştirilmesiyle görülen beklenen fenotipten daha şiddetli olduğunda, iki genin paralel yollarda işlev gördüğünü ve belirli bir işlevi birlikte etkilediğini ima eden ağırlaştırıcı mutasyonlar gözlenir. Buna karşılık, çift silme mutantının fenotipi, tek silme mutantlarında görülen fenotipten daha az şiddetli olduğunda hafifletici mutasyonlar gözlenir, bu da iki genin bir kompleks olarak birlikte hareket ettiğini veya aynı yola katıldığını imaeder 16,18. Buna göre, genetik etkileşimleri tanımlamak için ölümcüllük, büyüme oranları ve kuluçka büyüklüğü gibi geniş fenotipler ve transkripsiyon muhabirleri gibi spesifik fenotipler de dahil olmak üzere ölçülebilen çeşitli fenotipler kullanılmıştır. Örneğin, Jonikas ve arkadaşları, çift yönlü gen silme analizleri kullanarak Saccharomyces cerevisiae ER açılmamış protein yanıtı proteostaz ağının etkileşimlerini incelemek için bir ER stres muhabirine güvendi19.

Genetik etkileşim ekranları, kapsamlı bir çift mutant kümesi oluşturmak için çift yönlü silme mutasyonlarını sistematik olarak geçmeyi içerir20. Bununla birlikte, hayvan modellerinde ve özellikle C. elegans‘ta, bu büyük ölçekli yaklaşım mümkün değildir. Bunun yerine, mutant suşları, RNA paraziti (RNAi)21kullanılarak gen ekspresyonunu aşağı düzenleyerek genetik etkileşim kalıpları için test edilebilir. C. elegans RNAi22,23tabanlı ekranlar için güçlü bir sistemdir. C. elegans’ta,çift iplikli RNA (dsRNA) doğumu bakteriyel beslenme ile elde edilir ve dsRNA moleküllerinin çok sayıda dokuya yayılmasına yol açmaktadır. Bu şekilde, tanıtılan dsRNA molekülleri hayvanı hızlı ve basit bir prosedürle etkiler21. Bu nedenle, RNAi kullanan bir genetik etkileşim ekranı, RNAi kütüphanelerini kullanarak genleri kodlayan bir dizi geni veya çoğu C. elegans’ı aşağı düzenlemenin etkisini ortaya getirebilir24. Böyle bir ekranda, ilgi mutantının davranışını etkileyen ancak vahşi tip suşunu etkilemeyen isabetler, izlenen fenotipin potansiyel değiştiricileridir25. Burada, C. elegansdokuya özgü refakatçi etkileşimlerini sistematik olarak haritalamak için mutasyonların ve RNAi taramasının bir kombinasyonunu uyguluyoruz.

Protocol

1. RNAi için nematod büyüme medya plakalarının hazırlanması 1 L şişeye 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Peptone, 17 g agar ve 1 L’ye kadar damıtılmış su ekleyin ve otoklavlayın. 55 °C’ye kadar soğuk şişe. Nematod büyüme ortamı (NGM) yapmak için25mL 1 M KH 2 PO4, pH 6.0, 1 mL 1 M CaCl2,1 mL 1 M MgSO4ve 1 mL kolesterol çözeltisi (Tablo 1) ekleyin. NGM-RNAi çözeltisi yapmak için 1 mL ampisilin (100 mg/mL) ve …

Representative Results

UNC-45’te sıcaklığa duyarlı mutasyonların kullanılması, izin verilen veya kısıtlayıcı koşullar altında etkileşimlerin ağırlaştırılması veya hafifletilmesini taramak içinKas montajı ve bakımı, dokuya özgü refakatçi etkileşimlerini incelemek için etkili bir sistem sunar. Kasıt kaslarının fonksiyonel birimi olan sarkom, yapısal ve düzenleyici proteinlerin kristal benzeri bir düzenlemesini sunar. Motor protein miyozinin stabilitesi ve kas kas sarkomlarının kalın fila…

Discussion

Proteostaz ağının nasıl düzenlendiğini ve farklı metazoan hücre ve dokularda nasıl çalıştığını yansıtan entegre bir resmi eksik kalır. Bu eksikliği gidermek için, gelişim ve yaşlanma sırasında belirli dokularda moleküler refakatçiler gibi bu ağın çeşitli bileşenlerinin etkileşimleri hakkında özel bilgiler gereklidir. Burada, dokuya özgü pertürbasyonların kullanımının belirli bir dokudaki refakatçi ağını incelememizi nasıl sağladığını gösterdik. Dokuya özgü refakatçi …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NIH Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi (NCRR) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi’ne bazı nematod suşları için teşekkür ederiz. H.F. Epstein tarafından geliştirilen monoklonal antikorlar, NICHD himayesinde geliştirilen ve Iowa Üniversitesi Biyoloji Bölümü tarafından sürdürülen Gelişimsel Çalışmalar Hybridoma Bankası’ndan elde edildi. Bu araştırma İsrail Bilim Vakfı’nın (278/18 sayılı hibesi) ve İsrail Bilim ve Teknoloji Bakanlığı ile Dışişleri ve Uluslararası İşbirliği Bakanlığı, Ülke Tanıtım Genel Müdürlüğü, İtalya Cumhuriyeti’nin (3-14337 sayılı hibe) hibesi ile desteklendi. Ben-Zvi laboratuvarı üyelerine bu makalenin hazırlanmasında yardımcı olanlara teşekkür ederiz.

Materials

12-well-plates SPL BA3D16B
40 mm plates Greiner Bio-one 627160
60 mm plates Greiner Bio-one 628102
6-well plates Thermo Scientific 140675
96 well 2 mL 128.0/85mm Greiner Bio-one 780278
Agar Formedium AGA03
Ampicillin Formedium 69-52-3
bromophenol blue Sigma BO126-25G
CaCl2 Merck 1.02382.0500
Camera Qimaging q30548
Cholesterol Amresco 0433-250G
Confocal Leica DM5500
Filter (0.22 µm) Sigma SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope Leica MZ165FC
Glycerol Frutarom 2355519000024
IPTG Formedium 367-93-1
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 1.04873.1000
KOH Bio-Lab 001649029100
MgSO4 Fisher 22189-08-8 Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody Hybridoma Bank 5-6
Na2HPO4·7H2O Sigma s-0751
NaCl Bio-Lab 001903029100
Peptone Merck 61930705001730
Plate pouring pump Integra does it p920
RNAi Chaperone library NA NA
SDS VWR Life Science 0837-500
ß-mercaptoethanol Bio world 41300000-1
stereomicroscope Leica MZ6
Tetracycline Duchefa Biochemie 64-75-5
Tris Bio-Lab 002009239100
Tween-20 Fisher BP337-500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
  3. Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
  4. Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J. The HSP90 chaperone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 345-360 (2017).
  5. Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
  6. Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B. The Hsp70 chaperone network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  7. Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
  8. Bett, J. S. Proteostasis regulation by the ubiquitin system. Essays in Biochemistry. 60 (2), 143-151 (2016).
  9. Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
  10. Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
  11. Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
  12. Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
  13. O’Brien, D., van Oosten-Hawle, P. Regulation of cell-non-autonomous proteostasis in metazoans. Essays in Biochemistry. 60 (2), 133-142 (2016).
  14. Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
  15. Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
  16. Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
  17. Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
  18. Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
  19. Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
  20. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
  21. Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
  22. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  23. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  24. Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
  25. Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21 (2014).
  26. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  27. Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891 (2019).
  28. Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
  29. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
  30. Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644 (2013).
  31. Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
  32. Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
  33. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  34. Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
  35. Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
  36. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
  37. Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
  38. Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485 (2011).
  39. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  40. Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531 (2016).
  41. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
  42. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921 (2013).
  43. Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
  44. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  45. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  46. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  47. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  48. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
  49. Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
  50. Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
  51. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  52. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218 (2013).
  53. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  54. Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  55. Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
  56. Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
  57. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
  58. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  59. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  60. Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).

Tags

Caenorhabditis ElegansEmbryo SynchronizationM9 BufferNGM PlateCell ScraperCentrifugationSynchronized NematodesRNAiEmbryonic Lethality
check_url/61140?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions. J. Vis. Exp. (160), e61140, doi:10.3791/61140 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image