Utilisation de Caenorhabditis elegans pour dépister les interactions tissulaires spécifiques des chaperons

Summary

Pour étudier les interactions chaperon-chaperon et chaperone-substrat, nous effectuons des écrans d’interaction synthétique chez Caenorhabditis elegans en utilisant l’interférence ARN en combinaison avec des mutations légères ou une sur-expression des chaperons et surveillons le dysfonctionnement protéique spécifique des tissus au niveau de l’organisme.

Abstract

Le repliement et l’assemblage corrects des protéines et des complexes protéiques sont essentiels à la fonction cellulaire. Les cellules utilisent des voies de contrôle de la qualité qui corrigent, séquestrent ou éliminent les protéines endommagées pour maintenir un protéome sain, assurant ainsi la protéostasie cellulaire et prévenant d’autres dommages aux protéines. En raison de fonctions redondantes au sein du réseau de protéostasie, le dépistage des phénotypes détectables à l’aide de knockdown ou de mutations dans des gènes codant pour chaperon dans l’organisme multicellulaire Caenorhabditis elegans entraîne la détection de phénotypes mineurs ou nuls dans la plupart des cas. Nous avons développé une stratégie de dépistage ciblée pour identifier les accompagnateurs nécessaires à une fonction spécifique et ainsi combler le fossé entre le phénotype et la fonction. Plus précisément, nous surveillons de nouvelles interactions de chaperon à l’aide d’écrans d’interaction synthétiques de l’ARNi, renversant l’expression du chaperon, un chaperon à la fois, chez les animaux porteurs d’une mutation dans un gène codant pour chaperon ou surexprimant un chaperon d’intérêt. En perturbant deux chaperons qui ne présentent individuellement aucun phénotype brut, nous pouvons identifier les chaperons qui aggravent ou exposent un phénotype spécifique lorsque les deux sont perturbés. Nous démontrons que cette approche permet d’identifier des ensembles spécifiques d’accompagnateurs qui fonctionnent ensemble pour moduler le repliement d’une protéine ou de complexes protéiques associés à un phénotype donné.

Introduction

Les cellules font face aux dommages causés par les protéines en utilisant des machines de contrôle de la qualité qui réparent, séquestrent ou éliminent toutes les protéines endommagées^1,2. Le repliement et l’assemblage des complexes protéiques sont soutenus par des chaperons moléculaires, un groupe diversifié de protéines hautement conservées qui peuvent réparer ou séquestrer les protéines endommagées^3,4,5,6,7. L’élimination des protéines endommagées est médiée par le système ubiquitine-protéasome (UPS)⁸ ou par la machinerie d’autophagie⁹ en collaboration avec les chaperons^10,11,12. L’homéostasie protéique (protéostasie) est donc maintenue par des réseaux de contrôle de la qualité composés de machines de repliement et de dégradation^3,13. Cependant, comprendre les interactions entre les différentes composantes du réseau de protéostasie in vivo est un défi majeur. Alors que les écrans d’interaction protéine-protéine fournissent des informations importantes sur les interactions physiques et les complexes chaperons^14,15, la compréhension de l’organisation et des mécanismes compensatoires au sein des réseaux de chaperons spécifiques aux tissus in vivo fait défaut.

Les interactions génétiques sont souvent utilisées comme un outil puissant pour examiner la relation entre les paires de gènes impliqués dans les voies biologiques communes ou compensatoires^16,17,18. De telles relations peuvent être mesurées en combinant des paires de mutations et en quantifiant l’impact d’une mutation dans un gène sur la gravité phénotypique causée par une mutation dans le second gène¹⁶. Bien que la plupart de ces combinaisons ne montrent aucun effet en termes de phénotype, certaines interactions génétiques peuvent aggraver ou atténuer la gravité du phénotype mesuré. Des mutations aggravantes sont observées lorsque le phénotype du mutant à double délétion est plus grave que le phénotype attendu observé lors de la combinaison des mutants de délétion unique, ce qui implique que les deux gènes fonctionnent dans des voies parallèles, affectant ensemble une fonction donnée. En revanche, des mutations atténuantes sont observées lorsque le phénotype du mutant à double délétion est moins sévère que le phénotype observé avec les mutants à délétion simple, ce qui implique que les deux gènes agissent ensemble comme un complexe ou participent à la même voie^16,18. En conséquence, divers phénotypes qui peuvent être quantifiés, y compris des phénotypes larges, tels que la létalité, les taux de croissance et la taille du couvain, ainsi que des phénotypes spécifiques, tels que les rapporteurs transcriptionnels, ont été utilisés pour identifier les interactions génétiques. Par exemple, Jonikas et al. se sont appuyés sur un rapporteur de stress ER pour examiner les interactions du réseau de protéostasie de réponse protéique déployée par ER à l’aide d’analyses de délétion de gènes par paires¹⁹.

Les tests d’interaction génétique impliquent de croiser systématiquement les mutations de délétion par paires pour générer un ensemble complet de doubles mutants²⁰. Cependant, dans les modèles animaux, et en particulier chez C. elegans,cette approche à grande échelle n’est pas réalisable. Au lieu de cela, les souches mutantes peuvent être testées pour leurs modèles d’interaction génétique en régulant à la baisse l’expression des gènes à l’aide de l’interférence ARN (ARNi)²¹. C. elegans est un système puissant pour les écrans basé sur l’ARNi^22,23. Chez C. elegans,l’administration d’ARN double brin (ARNds) est obtenue par alimentation bactérienne, ce qui conduit à la propagation des molécules d’ARNds à de nombreux tissus. De cette manière, les molécules d’ARNd introduites impactent l’animal via une procédure rapide et simple²¹. Un criblage d’interaction génétique utilisant l’ARNi peut donc révéler l’impact de la régulation à la baisse d’un ensemble de gènes ou de la plupart des gènes codant pour C. elegans à l’aide de bibliothèques d’ARNi²⁴. Dans un tel écran, les hits qui impactent le comportement du mutant d’intérêt mais pas la souche de type sauvage sont des modificateurs potentiels du phénotype surveillé^25. Ici, nous appliquons une combinaison de mutations et de dépistage de l’ARNi pour cartographier systématiquement les interactions de chaperon spécifiques aux tissus chez C. elegans.

Protocol

1. Préparation de plaques de milieux de croissance de nématodes pour l’ARNi Dans une bouteille de 1 L, ajouter 3 g de NaCl, 2,5 g de Bacto-Peptone, 17 g de gélose et d’eau distillée jusqu’à 1 L et autoclave. Refroidir la bouteille à 55 °C. Ajouter 25 mL de 1 M KH2PO4,pH 6,0, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4et 1 mL de solution de cholestérol (Tableau 1) pour fabriquer un milieu de croissance des nématodes (NGM).</…

Representative Results

Utilisation de mutations sensibles à la température dans l’UNC-45 pour dépister les interactions aggravantes ou atténuantes dans des conditions permissives ou restrictives, respectivementL’assemblage et l’entretien musculaires offrent un système efficace pour étudier les interactions des chaperons spécifiques aux tissus. L’unité fonctionnelle des muscles contractiles, le sarcomère, présente un arrangement cristallin de protéines structurelles et régulatrices. La stabilité de la p…

Discussion

Une image intégrée du réseau de protéostasie reflétant son organisation et son fonctionnement dans différentes cellules et tissus métazoaires fait toujours défaut. Pour remédier à cette lacune, des informations spécifiques sur les interactions des différents composants de ce réseau, tels que les chaperons moléculaires, dans des tissus spécifiques au cours du développement et du vieillissement sont nécessaires. Ici, nous avons montré comment l’utilisation de perturbations spécifiques aux tissus nous a…

Materials

12-well-plates	SPL	BA3D16B
40 mm plates	Greiner Bio-one	627160
60 mm plates	Greiner Bio-one	628102
6-well plates	Thermo Scientific	140675
96 well 2 mL 128.0/85mm	Greiner Bio-one	780278
Agar	Formedium	AGA03
Ampicillin	Formedium	69-52-3
bromophenol blue	Sigma	BO126-25G
CaCl2	Merck	1.02382.0500
Camera	Qimaging	q30548
Cholesterol	Amresco	0433-250G
Confocal	Leica	DM5500
Filter (0.22 µm)	Sigma	SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope	Leica	MZ165FC
Glycerol	Frutarom	2355519000024
IPTG	Formedium	367-93-1
KCl	Merck	104936
KH2PO4	Merck	1.04873.1000
KOH	Bio-Lab	001649029100
MgSO4	Fisher	22189-08-8	Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody	Hybridoma Bank	5-6
Na2HPO4·7H2O	Sigma	s-0751
NaCl	Bio-Lab	001903029100
Peptone	Merck	61930705001730
Plate pouring pump	Integra	does it p920
RNAi Chaperone library	NA	NA
SDS	VWR Life Science	0837-500
ß-mercaptoethanol	Bio world	41300000-1
stereomicroscope	Leica	MZ6
Tetracycline	Duchefa Biochemie	64-75-5
Tris	Bio-Lab	002009239100
Tween-20	Fisher	BP337-500