Utilizzo di Caenorhabditis elegans per lo screening delle interazioni chaperone tessuto-specifiche
Summary
Per studiare le interazioni chaperone-chaperone e chaperone-substrato, eseguiamo screening di interazione sintetica in Caenorhabditis elegans utilizzando l’interferenza dell’RNA in combinazione con mutazioni lievi o sovraespressione di chaperoni e monitoriamo la disfunzione proteica tessuto-specifica a livello di organismo.
Abstract
Il corretto ripiegamento e assemblaggio di proteine e complessi proteici sono essenziali per la funzione cellulare. Le cellule impiegano percorsi di controllo della qualità che correggono, sequestrano o eliminano le proteine danneggiate per mantenere un proteoma sano, garantendo così la proteostasi cellulare e prevenendo ulteriori danni alle proteine. A causa delle funzioni ridondanti all’interno della rete di proteostasi, lo screening per fenotipi rilevabili utilizzando knockdown o mutazioni in geni chaperone-encoding nell’organismo multicellulare Caenorhabditis elegans porta alla rilevazione di fenotipi minori o nulli nella maggior parte dei casi. Abbiamo sviluppato una strategia di screening mirata per identificare gli accompagnatori necessari per una funzione specifica e quindi colmare il divario tra fenotipo e funzione. In particolare, monitoriamo nuove interazioni chaperone utilizzando schermi di interazione sintetica RNAi, abbattendo l’espressione dell’accompagnatore, un accompagnatore alla volta, in animali portatori di una mutazione in un gene che codifica per l’accompagnatore o sovraesprimendo un accompagnatore di interesse. Interrompendo due chaperoni che individualmente non presentano fenotipo grossolano, possiamo identificare chaperoni che aggravano o espongono un fenotipo specifico quando entrambi sono perturbati. Dimostriamo che questo approccio può identificare insiemi specifici di chaperoni che funzionano insieme per modulare il ripiegamento di una proteina o di complessi proteici associati a un dato fenotipo.
Introduction
Le cellule affrontano il danno proteico impiegando macchinari di controllo qualità che riparano, sequestrano o rimuovono eventuali proteine danneggiate1,2. Il ripiegamento e l’assemblaggio di complessi proteici sono supportati da chaperoni molecolari, un gruppo eterogeneo di proteine altamente conservate che possono riparare o sequestrare le proteine danneggiate3,4,5,6,7. La rimozione delle proteine danneggiate è mediata dal sistema ubiquitina-proteasoma (UPS)8 o dal macchinario autofagico9 in collaborazione con gli accompagnatori10,11,12. L’omeostasi proteica (proteostasi) è, quindi, mantenuta da reti di controllo qualità composte da macchinari di piegatura e degradazione3,13. Tuttavia, comprendere le interazioni tra i vari componenti della rete di proteostasi in vivo è una sfida importante. Mentre gli schermi di interazione proteina-proteina contribuiscono con informazioni importanti sulle interazioni fisiche e sui complessi di chaperone14,15, manca la comprensione dell’organizzazione e dei meccanismi compensatori all’interno delle reti di chaperone tessuto-specifiche in vivo.
Le interazioni genetiche sono spesso utilizzate come un potente strumento per esaminare la relazione tra coppie di geni che sono coinvolti in percorsi biologici comuni o compensatori16,17,18. Tali relazioni possono essere misurate combinando coppie di mutazioni e quantificando l’impatto di una mutazione in un gene sulla gravità fenotipica causata da una mutazione nel secondo gene16. Mentre la maggior parte di tali combinazioni non mostra alcun effetto in termini di fenotipo, alcune interazioni genetiche possono aggravare o alleviare la gravità del fenotipo misurato. Mutazioni aggravanti si osservano quando il fenotipo del mutante a doppia delezione è più grave del fenotipo atteso visto combinando i mutanti a delezione singola, il che implica che i due geni funzionano in percorsi paralleli, influenzando insieme una data funzione. Al contrario, le mutazioni attenuanti si osservano quando il fenotipo del mutante a doppia delezione è meno grave del fenotipo osservato con i mutanti a delezione singola, il che implica che i due geni agiscono insieme come un complesso o partecipano alla stessa via16,18. Di conseguenza, diversi fenotipi che possono essere quantificati, compresi fenotipi ampi, come letalità, tassi di crescita e dimensioni della covata, nonché fenotipi specifici, come i reporter trascrizionali, sono stati utilizzati per identificare le interazioni genetiche. Ad esempio, Jonikas et al. si sono affidati a un reporter dello stress ER per esaminare le interazioni della rete di proteostasi della risposta proteica dispiegata saccharomyces cerevisiae ER utilizzando analisi di delezione genica a coppie19.
Gli screening di interazione genetica comportano l’incrocio sistematico di mutazioni di delezione a coppie per generare un set completo di doppi mutanti20. Tuttavia, nei modelli animali, e in particolare in C. elegans, questo approccio su larga scala non è fattibile. Invece, i ceppi mutanti possono essere testati per i loro modelli di interazione genetica regolando l’espressione genica utilizzando l’interferenza dell’RNA (RNAi)21. C. elegans è un potente sistema per schermi basato su RNAi22,23. In C. elegans, la consegna di RNA a doppio filamento (dsRNA) è ottenuta mediante alimentazione batterica, portando alla diffusione di molecole di dsRNA a numerosi tessuti. In questo modo, le molecole di dsRNA introdotte hanno un impatto sull’animale attraverso una procedura rapida e semplice21. Uno screening di interazione genetica che utilizza RNAi può, quindi, rivelare l’impatto della down-regolazione di un insieme di geni o della maggior parte dei geni codificanti C. elegans utilizzando le librerie RNAi24. In tale schermo, i colpi che influenzano il comportamento del mutante di interesse ma non il ceppo wild type sono potenziali modificatori del fenotipo monitorato25. Qui, applichiamo una combinazione di mutazioni e screening RNAi per mappare sistematicamente le interazioni chaperone tessuto-specifiche in C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rimane carente un quadro integrato della rete di proteostasi che rifletta come è organizzata e funziona in diverse cellule e tessuti metazoici. Per affrontare questa carenza, sono necessarie informazioni specifiche sulle interazioni di vari componenti di questa rete, come gli accompagnatori molecolari, in tessuti specifici durante il corso dello sviluppo e dell’invecchiamento. Qui, abbiamo mostrato come l’uso di perturbazioni tessuto-specifiche ci ha permesso di esaminare la rete di chaperone in un determinato tessuto. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Caenorhabditis Genetics Center, finanziato dal NIH National Center for Research Resources (NCRR), per alcuni dei ceppi di nematodi. Gli anticorpi monoclonali sviluppati da H.F. Epstein sono stati ottenuti dallo Developmental Studies Hybridoma Bank sviluppato sotto gli auspici del NICHD e mantenuto dal Dipartimento di Biologia dell’Università dell’Iowa. Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione della Israel Science Foundation (sovvenzione n. 278/18) e da una sovvenzione del Ministero israeliano della Scienza e della Tecnologia, e del Ministero degli Affari Esteri e della Cooperazione Internazionale, Direzione Generale per la Promozione del Paese, Repubblica Italiana (sovvenzione n. 3-14337). Ringraziamo i membri del laboratorio Ben-Zvi per l’aiuto nella preparazione di questo manoscritto.
Materials
| 12-well-plates | SPL | BA3D16B | |
| 40 mm plates | Greiner Bio-one | 627160 | |
| 60 mm plates | Greiner Bio-one | 628102 | |
| 6-well plates | Thermo Scientific | 140675 | |
| 96 well 2 mL 128.0/85mm | Greiner Bio-one | 780278 | |
| Agar | Formedium | AGA03 | |
| Ampicillin | Formedium | 69-52-3 | |
| bromophenol blue | Sigma | BO126-25G | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | |
| Camera | Qimaging | q30548 | |
| Cholesterol | Amresco | 0433-250G | |
| Confocal | Leica | DM5500 | |
| Filter (0.22 µm) | Sigma | SCGPUO2RE | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ165FC | |
| Glycerol | Frutarom | 2355519000024 | |
| IPTG | Formedium | 367-93-1 | |
| KCl | Merck | 104936 | |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873.1000 | |
| KOH | Bio-Lab | 001649029100 | |
| MgSO4 | Fisher | 22189-08-8 | Gift from the Morimoto laboratory |
| Myosin MHC A (MYO-3) antibody | Hybridoma Bank | 5-6 | |
| Na2HPO4·7H2O | Sigma | s-0751 | |
| NaCl | Bio-Lab | 001903029100 | |
| Peptone | Merck | 61930705001730 | |
| Plate pouring pump | Integra | does it p920 | |
| RNAi Chaperone library | NA | NA | |
| SDS | VWR Life Science | 0837-500 | |
| ß-mercaptoethanol | Bio world | 41300000-1 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Tetracycline | Duchefa Biochemie | 64-75-5 | |
| Tris | Bio-Lab | 002009239100 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 |
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