Использование Caenorhabditis elegans для скрининга тканеспецифических взаимодействий шаперонов
Summary
Для изучения взаимодействия шаперон-шаперон и шаперон-субстрат мы проводим синтетические экраны взаимодействия у Caenorhabditis elegans с использованием РНК-интерференции в сочетании с легкими мутациями или чрезмерной экспрессией шаперонов и контролируем тканеспецифическую белковую дисфункцию на уровне организма.
Abstract
Правильное сворачивание и сборка белков и белковых комплексов необходимы для клеточной функции. Клетки используют пути контроля качества, которые корректируют, изолируют или устраняют поврежденные белки для поддержания здорового протеома, тем самым обеспечивая клеточный протеостаз и предотвращая дальнейшее повреждение белка. Из-за избыточных функций в сети протеостаза скрининг на обнаруживаемые фенотипы с использованием нокдауна или мутаций в генах, кодирующих шапероны, в многоклеточном организме Caenorhabditis elegans приводит к обнаружению незначительных фенотипов или их отсутствия в большинстве случаев. Мы разработали стратегию целевого скрининга для выявления шаперонов, необходимых для конкретной функции, и, таким образом, преодоления разрыва между фенотипом и функцией. В частности, мы отслеживаем новые взаимодействия шаперонов с использованием экранов синтетического взаимодействия RNAi, сбивая экспрессию шаперона, по одному шаперону за раз, у животных, несущих мутацию в гене, кодируемом шапероном, или чрезмерно экспрессирующих интересующий шаперон. Разрушая два шаперона, которые по отдельности не представляют грубого фенотипа, мы можем идентифицировать шапероны, которые усугубляют или подвергают воздействию определенный фенотип, когда оба возмущены. Мы демонстрируем, что этот подход может идентифицировать конкретные наборы шаперонов, которые функционируют вместе, модулируя сворачивание белка или белковых комплексов, связанных с данным фенотипом.
Introduction
Клетки справляются с повреждением белка, используя механизмы контроля качества, которые восстанавливают, изолируют или удаляют любые поврежденные белки1,2. Сворачивание и сборка белковых комплексов поддерживаются молекулярными шаперонами, разнообразной группой высокосохраняемых белков, которые могут восстанавливать или секвестрировать поврежденные белки3,4,5,6,7. Удаление поврежденных белков опосредовано убиквитин-протеасомной системой (UPS)8 или механизмом аутофагии9 в сотрудничестве с шаперонами10,11,12. Таким образом, белковый гомеостаз (протеостаз) поддерживается сетями контроля качества, состоящими из механизмов сворачивания и деградации3,13. Однако понимание взаимодействия между различными компонентами сети протеостаза in vivo является серьезной проблемой. В то время как экраны белково-белкового взаимодействия вносят важную информацию о физических взаимодействиях и шапероновых комплексах14,15,понимание организации и компенсаторных механизмов в тканеспецифических шапероновых сетях in vivo отсутствует.
Генетические взаимодействия часто используются в качестве мощного инструмента для изучения отношений между парами генов, которые участвуют в общих или компенсаторных биологических путях16,17,18. Такие отношения могут быть измерены путем объединения пар мутаций и количественной оценки влияния мутации в одном гене на фенотипическую тяжесть, вызванную мутацией во втором гене16. Хотя большинство таких комбинаций не показывают никакого эффекта с точки зрения фенотипа, некоторые генетические взаимодействия могут либо усугубить, либо облегчить тяжесть измеренного фенотипа. Усугубляющие мутации наблюдаются, когда фенотип мутанта с двойной делецией более серьезен, чем ожидаемый фенотип, наблюдаемый при объединении мутантов с одинаровой делецией, подразумевая, что два гена функционируют параллельными путями, вместе влияя на данную функцию. Напротив, смягчающие мутации наблюдаются, когда фенотип мутанта с двойной делецией менее серьезен, чем фенотип, наблюдаемый с мутантами с одинаровой делецией, подразумевая, что два гена действуют вместе как комплекс или участвуют в одном и том же пути16,18. Соответственно, для идентификации генетических взаимодействий использовались различные фенотипы, которые могут быть количественно определены, включая широкие фенотипы, такие как летальность, скорость роста и размер расплода, а также конкретные фенотипы, такие как транскрипционные репортеры. Например, Jonikas et al. полагались на репортера стресса ER для изучения взаимодействий Saccharomyces cerevisiae ER развернутой сети протеостаза белкового ответа с использованием парного анализа делеции генов19.
Скрининг генетического взаимодействия включает в себя систематическое скрещивание парных мутаций делеции для создания всеобъемлющего набора двойных мутантов20. Однако на животных моделях, и особенно у C. elegans,такой крупномасштабный подход неосуществим. Вместо этого мутантные штаммы могут быть проверены на их генетические паттерны взаимодействия путем снижения экспрессии генов с использованием РНК-интерференции (РНКи)21. C. elegans представляет собой мощную систему для экранов на основе РНКи22,23. У C. elegansдоставка двухцепочечной РНК (дцРНК) достигается путем бактериального питания, что приводит к распространению молекул дцРНК на многочисленные ткани. Таким образом, введенные молекулы дцРНК воздействовляют на животное с помощью быстрой и простой процедуры21. Таким образом, скрининг генетического взаимодействия с использованием РНК Может выявить влияние понижения регуляции набора генов или большинства генов C. elegans, кодирующих с использованием библиотек РНКи24. На таком экране удары, которые влияют на поведение интересующего мутанта, но не на штамм дикого типа, являются потенциальными модификаторами фенотипа, за которым ведется наблюдение25. Здесь мы применяем комбинацию мутаций и скрининга РНКи для систематического картирования тканеспецифических взаимодействий шаперонов у C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Интегрированная картина сети протеостаза, отражающая, как она организована и функционирует в различных метазойных клетках и тканях, по-прежнему отсутствует. Для устранения этого недостатка требуется конкретная информация о взаимодействиях различных компонентов этой сети, таких как ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Генетический центр Caenorhabditis, финансируемый Национальным центром исследовательских ресурсов NIH (NCRR), за некоторые штаммы нематод. Моноклональные антитела, разработанные Х.Ф. Эпштейном, были получены из Банка исследований развития Hybridoma, разработанного под эгидой NICHD и поддерживаемого кафедрой биологии Университета Айовы. Это исследование было поддержано грантом Израильского научного фонда (грант No 278/18) и грантом Министерства науки и технологий Израиля и Министерства иностранных дел и международного сотрудничества, Главного управления по продвижению стран, Итальянская Республика (грант No 3-14337). Благодарим сотрудников лаборатории Бен-Цви за помощь в подготовке этой рукописи.
Materials
| 12-well-plates | SPL | BA3D16B | |
| 40 mm plates | Greiner Bio-one | 627160 | |
| 60 mm plates | Greiner Bio-one | 628102 | |
| 6-well plates | Thermo Scientific | 140675 | |
| 96 well 2 mL 128.0/85mm | Greiner Bio-one | 780278 | |
| Agar | Formedium | AGA03 | |
| Ampicillin | Formedium | 69-52-3 | |
| bromophenol blue | Sigma | BO126-25G | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | |
| Camera | Qimaging | q30548 | |
| Cholesterol | Amresco | 0433-250G | |
| Confocal | Leica | DM5500 | |
| Filter (0.22 µm) | Sigma | SCGPUO2RE | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ165FC | |
| Glycerol | Frutarom | 2355519000024 | |
| IPTG | Formedium | 367-93-1 | |
| KCl | Merck | 104936 | |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873.1000 | |
| KOH | Bio-Lab | 001649029100 | |
| MgSO4 | Fisher | 22189-08-8 | Gift from the Morimoto laboratory |
| Myosin MHC A (MYO-3) antibody | Hybridoma Bank | 5-6 | |
| Na2HPO4·7H2O | Sigma | s-0751 | |
| NaCl | Bio-Lab | 001903029100 | |
| Peptone | Merck | 61930705001730 | |
| Plate pouring pump | Integra | does it p920 | |
| RNAi Chaperone library | NA | NA | |
| SDS | VWR Life Science | 0837-500 | |
| ß-mercaptoethanol | Bio world | 41300000-1 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Tetracycline | Duchefa Biochemie | 64-75-5 | |
| Tris | Bio-Lab | 002009239100 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 |
References
- Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
- Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
- Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
- Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J. The HSP90 chaperone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 345-360 (2017).
- Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
- Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B. The Hsp70 chaperone network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
- Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
- Bett, J. S. Proteostasis regulation by the ubiquitin system. Essays in Biochemistry. 60 (2), 143-151 (2016).
- Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
- Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
- Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
- Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
- O’Brien, D., van Oosten-Hawle, P. Regulation of cell-non-autonomous proteostasis in metazoans. Essays in Biochemistry. 60 (2), 133-142 (2016).
- Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
- Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
- Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
- Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
- Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
- Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
- Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
- Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
- Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
- Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21 (2014).
- Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
- Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891 (2019).
- Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
- Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
- Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644 (2013).
- Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
- Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
- Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
- Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
- Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
- Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
- Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
- Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485 (2011).
- Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
- Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531 (2016).
- Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
- Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921 (2013).
- Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
- Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
- Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
- Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
- Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
- Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
- Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
- Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218 (2013).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
- Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
- Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
- Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
- Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
- Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).
