JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

שימוש באלגנים של Caenorhabditis למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות

Published: June 07, 2020
doi:
10.3791/61140
, , ,
1Department of Life Sciences,Ben-Gurion University of the Negev

Summary

כדי לחקור אינטראקציות מלווה מלווה מלווה-מצע, אנו מבצעים מסכי אינטראקציה סינתטית ב elegans Caenorhabditis באמצעות הפרעות RNA בשילוב עם מוטציות קלות או ביטוי יתר של מלווים ולנטר תפקוד לקוי של חלבון ספציפי לרקמות ברמה האורגנית.

Abstract

קיפול והרכבה נכונים של חלבונים ומתחמי חלבון חיוניים לתפקוד התא. תאים משתמשים במסלולי בקרת איכות המתקנים, מבודדים או מבטלים חלבונים פגומים כדי לשמור על פרוטאום בריא, ובכך מבטיחים פרוטאוסטזיס תאי ומונעים נזק נוסף לחלבון. בגלל פונקציות יתירות בתוך רשת proteostasis, הקרנה עבור פנוטיפים לגילוי באמצעות נוקאאוט או מוטציות בגנים קידוד מלווה באורגניזם הרב תאי Caenorhabditis elegans תוצאות גילוי של פנוטיפים קלים או ללא ברוב המקרים. פיתחנו אסטרטגיית סינון ממוקדת לזיהוי מלווים הנדרשים לפונקציה מסוימת ובכך לגשר על הפער בין פנוטיפ לתפקוד. באופן ספציפי, אנו עוקבים אחר אינטראקציות מלווה חדשניות באמצעות מסכי אינטראקציה סינתטית RNAi, הבעת ביטוי מלווה, מלווה אחד בכל פעם, בבעלי חיים הנושאים מוטציה בגן קידוד מלווה או הבעת יתר של מלווה של עניין. על ידי שיבוש שני מלווים כי בנפרד להציג פנוטיפ ברוטו, אנו יכולים לזהות מלווים להחמיר או לחשוף פנוטיפ מסוים כאשר שניהם מוטרדים. אנו מדגימים כי גישה זו יכולה לזהות קבוצות ספציפיות של מלווים הפועלים יחד כדי לווסת את הקיפול של קומפלקס חלבון או חלבון הקשורים פנוטיפ נתון.

Introduction

תאים להתמודד עם נזק חלבון על ידי שימוש במכונות בקרת איכות לתקן, לבודד או להסיר חלבונים פגומים1,2. קיפול והרכבה של מתחמי חלבון נתמכים על ידי מלווים מולקולריים, קבוצה מגוונת של חלבונים שמורים מאוד שיכולים לתקן או לבודד חלבונים פגומים3,4,5,6,7. הסרת חלבונים פגומים בתיווך מערכת ubiquitin-proteasome (UPS)8 או על ידי מכונות autophagy9 בשיתוף עםמלווים 10,11,12. הומיוסטזיס חלבון (פרוטאוסטזיס) הוא, אם כן, מתוחזק על ידי רשתות בקרת איכות המורכבות ממכונות קיפול והשפלה3,13. עם זאת, הבנת האינטראקציות בין המרכיבים השונים של רשת הפרוטאוסטזיס ב- vivo היא אתגר גדול. בעוד שמסכי אינטראקציה בין חלבון חלבון תורמים מידע חשוב על אינטראקציות פיזיות ומתחמי ליווי14,15, הבנת הארגון ומנגנוני פיצוי בתוך רשתות ליווי ספציפיות לרקמות ב- vivo חסרה.

אינטראקציות גנטיות משמשות לעתים קרובות ככלי רב עוצמה לבחינת קשר בין זוגות גנים המעורבים במסלולים ביולוגיים נפוצים או מפצים16,17,18. יחסים כאלה יכולים להימדד על ידי שילוב זוגות של מוטציות וכימות ההשפעה של מוטציה בגן אחד על החומרה הפנוטיפית הנגרמת על ידי מוטציה בגן השני16. בעוד שרוב השילובים כאלה אינם מראים כל השפעה במונחים של פנוטיפ, כמה אינטראקציות גנטיות יכול גם להחמיר או להקל על חומרת הפנוטיפ הנמדד. מוטציות מחמירות נצפות כאשר הפנוטיפ של מוטציית המחיקה הכפולה חמור יותר מהפנוטיפ הצפוי שנראה בשילוב מוטציות המחיקה הבודדות, מה שמרמז על כך ששני הגנים מתפקדים במסלולים מקבילים, יחד המשפיעים על תפקוד נתון. לעומת זאת, מוטציות מקלות נצפות כאשר הפנוטיפ של מוטציית המחיקה הכפולה הוא פחות חמור מהפנוטיפ שנראה עם מוטציות המחיקה הבודדות, מה שמרמז על כך ששני הגנים פועלים יחד כמורכב או משתתפים באותו מסלול16,18. בהתאם לכך, פנוטיפים מגוונים שניתן לכמת, כולל פנוטיפים רחבים, כגון קטלניות, שיעורי צמיחה וגודל הגוזל, כמו גם פנוטיפים ספציפיים, כגון כתבים תמלול, שימשו לזיהוי אינטראקציות גנטיות. לדוגמה, Jonikas ואח ‘ הסתמכו על כתב מתח ER לבחון אינטראקציות של Saccharomyces cerevisiae ER פתחה רשת פרוטאוסטזיס תגובת חלבון באמצעות ניתוחי מחיקת גנים זוגגנים 19.

מסכי אינטראקציה גנטית כרוכים בחצייה שיטתית של מוטציות מחיקה זוגיות כדי ליצור קבוצה מקיפה של מוטציות כפולות20. עם זאת, במודלים של בעלי חיים, ובמיוחד ב- C. elegans, גישה רחבת היקף זו אינה ריאלית. במקום זאת, זנים מוטנטיים יכולים להיבדק לדפוסי האינטראקציה הגנטית שלהם על ידי זיהוי גנים מווסת באמצעות הפרעות RNA (RNAi)21. ג. אלגנס היא מערכת רבת עוצמה למסכים המבוססת על RNAi22,23. ב C. elegans, משלוח RNA כפול גדילים (dsRNA) מושגת על ידי האכלה חיידקית, מה שמוביל להתפשטות של מולקולות dsRNA לרקמות רבות. באופן זה, מולקולות dsRNA הציג להשפיע על החיה באמצעות הליך מהיר ופשוט21. מסך אינטראקציה גנטית באמצעות RNAi יכול, אם כן, לחשוף את ההשפעה של ויסות מטה קבוצה של גנים או רוב C. elegans קידוד גנים באמצעות ספריות RNAi24. במסך כזה, להיטים המשפיעים על ההתנהגות של מוטציה של עניין אבל לא זן סוג פראי הם מכפילים פוטנציאליים של פנוטיפ להיות במעקב25. כאן, אנו מיישמים שילוב של מוטציות והקרנת RNAi כדי למפות באופן שיטתי אינטראקציות מלווה ספציפיות לרקמות ב- C. elegans.

Protocol

1. הכנת לוחות מדיה צמיחה נמטודה עבור RNAi לבקבוק 1 L, הוסיפו 3 גרם של NaCl, 2.5 גרם של Bacto-Peptone, 17 גרם אגר ומים מזוקקים עד 1 L ו autoclave. בקבוק מגניב ל 55 °C (55 °F). הוסף 25 מ”ל של 1 M KH2PO4, pH 6.0, 1 מ”ל של 1 M CaCl2, 1 מ”ל של 1 M MgSO4, ו 1 מ”ל של פתרוןכולסטרול (טבלה 1) כדי להפוך את מדי?…

Representative Results

שימוש במוטציות רגישות לטמפרטורה ב-UNC-45 כדי לסנן להחמיר או להקל על אינטראקציות בתנאים מתירניים או מגבילים, בהתאמההרכבה ותחזוקת שרירים מציעים מערכת יעילה לחקר אינטראקציות מלווה ספציפיות לרקמות. היחידה התפקודית של שרירים מתכווצים, הסרקומר, מציגה סידור דמוי גבישי של חלבונים מבני?…

Discussion

תמונה משולבת של רשת הפרוטאוסטזיס המשקפת כיצד היא מאורגנת ומתפקדת בתאים ורקמות מטזואניים שונים נותרה חסרה. כדי להתמודד עם חסרונות אלה, נדרש מידע ספציפי על האינטראקציות של רכיבים שונים של רשת זו, כגון מלווים מולקולריים, ברקמות ספציפיות במהלך ההתפתחות וההזדקנות. כאן, הראינו כיצד השימוש בהתע…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים למרכז לגנטיקה של Caenorhabditis, במימון המרכז הלאומי למשאבי מחקר של NIH (NCRR), על חלק מזני הנמטודה. נוגדנים חד שבטיים שפותחו על ידי ה.פ. אפשטיין התקבלו מבנק ההיברידיומה למחקרים התפתחותיים שפותח בחסות ה- NICHD ומתוחזק על ידי המחלקה לביולוגיה, אוניברסיטת איווה. מחקר זה נתמך על ידי מענק של הקרן הישראלית למדע (מענק מס’ 278/18) ובמענק ממשרד המדע והטכנולוגיה ומשרד החוץ ושיתוף הפעולה הבינלאומי, המנהל הכללי לקידום המדינה, הרפובליקה האיטלקית (מענק מס’ 14337). אנו מודים לחברי מעבדת בן צבי על העזרה בהכנת כתב יד זה.

Materials

12-well-plates SPL BA3D16B
40 mm plates Greiner Bio-one 627160
60 mm plates Greiner Bio-one 628102
6-well plates Thermo Scientific 140675
96 well 2 mL 128.0/85mm Greiner Bio-one 780278
Agar Formedium AGA03
Ampicillin Formedium 69-52-3
bromophenol blue Sigma BO126-25G
CaCl2 Merck 1.02382.0500
Camera Qimaging q30548
Cholesterol Amresco 0433-250G
Confocal Leica DM5500
Filter (0.22 µm) Sigma SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope Leica MZ165FC
Glycerol Frutarom 2355519000024
IPTG Formedium 367-93-1
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 1.04873.1000
KOH Bio-Lab 001649029100
MgSO4 Fisher 22189-08-8 Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody Hybridoma Bank 5-6
Na2HPO4·7H2O Sigma s-0751
NaCl Bio-Lab 001903029100
Peptone Merck 61930705001730
Plate pouring pump Integra does it p920
RNAi Chaperone library NA NA
SDS VWR Life Science 0837-500
ß-mercaptoethanol Bio world 41300000-1
stereomicroscope Leica MZ6
Tetracycline Duchefa Biochemie 64-75-5
Tris Bio-Lab 002009239100
Tween-20 Fisher BP337-500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
  3. Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
  4. Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J. The HSP90 chaperone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 345-360 (2017).
  5. Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
  6. Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B. The Hsp70 chaperone network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  7. Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
  8. Bett, J. S. Proteostasis regulation by the ubiquitin system. Essays in Biochemistry. 60 (2), 143-151 (2016).
  9. Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
  10. Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
  11. Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
  12. Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
  13. O’Brien, D., van Oosten-Hawle, P. Regulation of cell-non-autonomous proteostasis in metazoans. Essays in Biochemistry. 60 (2), 133-142 (2016).
  14. Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
  15. Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
  16. Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
  17. Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
  18. Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
  19. Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
  20. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
  21. Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
  22. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  23. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  24. Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
  25. Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21 (2014).
  26. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  27. Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891 (2019).
  28. Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
  29. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
  30. Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644 (2013).
  31. Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
  32. Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
  33. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  34. Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
  35. Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
  36. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
  37. Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
  38. Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485 (2011).
  39. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  40. Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531 (2016).
  41. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
  42. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921 (2013).
  43. Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
  44. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  45. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  46. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  47. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  48. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
  49. Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
  50. Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
  51. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  52. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218 (2013).
  53. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  54. Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  55. Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
  56. Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
  57. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
  58. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  59. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  60. Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).

Tags

Caenorhabditis ElegansEmbryo SynchronizationM9 BufferNGM PlateCell ScraperCentrifugationSynchronized NematodesRNAiEmbryonic Lethality
check_url/61140?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions. J. Vis. Exp. (160), e61140, doi:10.3791/61140 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image