Bruke Caenorhabditis elegans til å screene for vevsspesifikke chaperone interaksjoner

Summary

For å studere chaperone-chaperone og chaperone-substrat interaksjoner, utfører vi syntetiske interaksjonsskjermer i Caenorhabditis elegans ved hjelp av RNA-interferens i kombinasjon med milde mutasjoner eller overuttrykk av anstander og overvåker vevsspesifikk proteindysfunksjon på organismenivå.

Abstract

Korrekt folding og montering av proteiner og proteinkomplekser er avgjørende for cellulær funksjon. Celler bruker kvalitetskontrollveier som korrigerer, fanger eller eliminerer skadede proteiner for å opprettholde et sunt proteom, og sikrer dermed cellulær proteostase og forhindrer ytterligere proteinskade. På grunn av redundante funksjoner i proteostasenettverket, screening for påvisbare fenotyper ved hjelp av knockdown eller mutasjoner i anstandskodingsgener i den multicellulære organismen Caenorhabditis elegans resulterer i påvisning av mindre eller ingen fenotyper i de fleste tilfeller. Vi har utviklet en målrettet screeningstrategi for å identifisere anstander som kreves for en bestemt funksjon og dermed bygge bro mellom fenotype og funksjon. Spesielt overvåker vi nye anstandsinteraksjoner ved hjelp av RNAi syntetiske interaksjonsskjermer, knocking-down chaperone uttrykk, en anstand om gangen, hos dyr som bærer en mutasjon i et anstandskodingsgen eller over-uttrykker en anstand av interesse. Ved å forstyrre to anstander som individuelt ikke presenterer noen grov fenotype, kan vi identifisere anstander som forverrer eller eksponerer en bestemt fenotype når begge er forstyrret. Vi viser at denne tilnærmingen kan identifisere spesifikke sett med anstander som fungerer sammen for å modulere foldingen av et protein- eller proteinkomplekser forbundet med en gitt fenotype.

Introduction

Celler takler proteinskader ved å bruke kvalitetskontrollmaskiner som reparerer, beslaglegger eller fjerner skadede proteiner^1,2. Folding og montering av proteinkomplekser støttes av molekylære anstander, en mangfoldig gruppe svært konserverte proteiner som kan reparere eller sequester skadede proteiner^3,4,5,6,7. Fjerning av skadede proteiner formidles av ubiquitin-proteasome systemet (UPS)⁸ eller av autofagi maskineri⁹ i samarbeid med chaperones^10,11,12. Protein homeostase (proteostase) opprettholdes derfor av kvalitetskontrollnettverk som består av folde- og nedbrytningsmaskiner^3,13. Det er imidlertid en stor utfordring å forstå samspillet mellom de ulike komponentene i proteostasenettverket in vivo. Mens proteinprotein interaksjonsskjermer bidrar med viktig informasjon om fysiske interaksjoner og anstandskomplekser^14,15, mangler det å forstå organisasjonen og kompenserende mekanismer innen vevsspesifikke anstandsnettverk in vivo.

Genetiske interaksjoner brukes ofte som et kraftig verktøy for å undersøke forholdet mellom par gener som er involvert i vanlige eller kompenserende biologiske veier^16,17,18. Slike forhold kan måles ved å kombinere par mutasjoner og kvantifisere virkningen av en mutasjon i ett gen på fenotypisk alvorlighetsgrad forårsaket av en mutasjon i det andre genet¹⁶. Mens de fleste slike kombinasjoner ikke viser noen effekt når det gjelder fenotype, kan noen genetiske interaksjoner enten forverre eller lindre alvorlighetsgraden av den målte fenotypen. Skjerpende mutasjoner observeres når fenotypen til den doble slettingsmutanten er mer alvorlig enn den forventede fenotypen sett ved å kombinere de enkle slettingsmutantene, noe som antyder at de to genene fungerer parallelt, sammen påvirker en gitt funksjon. Til sammenligning observeres lindrende mutasjoner når fenotypen til den doble slettingsmutanten er mindre alvorlig enn fenotypen sett med de enkelte slettingsmutantene, noe som antyder at de to genene fungerer sammen som et kompleks eller deltar i samme vei^16,18. Følgelig har forskjellige fenotyper som kan kvantifiseres, inkludert brede fenotyper, som dødelighet, vekstrater og brødstørrelse, samt spesifikke fenotyper, som transkripsjonelle reportere, blitt brukt til å identifisere genetiske interaksjoner. For eksempel stolte Jonikas et al. på en ER stressreporter for å undersøke interaksjoner mellom Saccharomyces cerevisiae ER utfoldet proteinresponsproteostasenettverk ved hjelp av parvise genslettingsanalyser¹⁹.

Genetiske interaksjonsskjermer innebærer systematisk kryssing av parvis sletting av mutasjoner for å generere et omfattende sett med doble mutanter²⁰. Men i dyremodeller, og spesielt i C. elegans, er denne store tilnærmingen ikke mulig. I stedet kan mutante stammer testes for deres genetiske interaksjonsmønstre ved å regulere genuttrykket ned ved hjelp av RNA-interferens (RNAi)²¹. C. elegans er et kraftig system for skjermer basert på RNAi^22,23. I C. elegansoppnås dobbeltstrenget RNA (dsRNA) levering ved bakteriell fôring, noe som fører til spredning av dsRNA-molekyler til mange vev. På denne måten påvirker de introduserte dsRNA-molekylene dyret via en rask og enkel prosedyre²¹. En genetisk interaksjonsskjerm ved hjelp av RNAi kan derfor avsløre virkningen av å regulere et sett med gener eller de fleste C. elegans-kodegener ved hjelp av RNAi-biblioteker²⁴. I en slik skjerm, treff som påvirker oppførselen til mutanten av interesse, men ikke den ville typen belastning er potensielle modifikatorer av fenotypen som overvåkes²⁵. Her bruker vi en kombinasjon av mutasjoner og RNAi screening for systematisk å kartlegge vevsspesifikke anstandsinteraksjoner i C. elegans.

Protocol

1. Utarbeidelse av nematode vekstmedieplater for RNAi Til en 1 L flaske, tilsett 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Peptone, 17 g agar og destillert vann opp til 1 L og autoklav. Avkjøl flasken til 55 °C. Tilsett 25 ml 1 M KH2PO4, pH 6,0, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4og 1 ml kolesteroloppløsning (tabell 1) for å lage nematodevekstmedier (NGM). Tilsett 1 ml ampicillin (100 mg/ml) og 0,5 ml 1 M IPTG (tabell 1) for …

Representative Results

Bruke temperaturfølsomme mutasjoner i UNC-45 til å screene for å forverre eller lindre interaksjoner under tillatte eller restriktive forhold, henholdsvisMuskelmontering og vedlikehold tilbyr et effektivt system for å studere vevsspesifikke anstandsinteraksjoner. Den funksjonelle enheten av kontraktil muskler, sarcomere, presenterer et krystallinsk-lignende arrangement av strukturelle og regulatoriske proteiner. Stabiliteten til motorproteinet myosin og dets inkorporering i de tykke filamentene a…

Discussion

Et integrert bilde av proteostasenettverket som reflekterer hvordan det er organisert og fungerer i forskjellige metazoanske celler og vev, mangler fortsatt. For å løse denne mangelen er det nødvendig med spesifikk informasjon om samspillet mellom ulike komponenter i dette nettverket, for eksempel molekylære anstander, i bestemte vev i løpet av utvikling og aldring. Her viste vi hvordan bruk av vevsspesifikke perturbasjoner gjorde det mulig for oss å undersøke anstandsnettverket i et gitt vev. For å utforske vevs…

Materials

12-well-plates	SPL	BA3D16B
40 mm plates	Greiner Bio-one	627160
60 mm plates	Greiner Bio-one	628102
6-well plates	Thermo Scientific	140675
96 well 2 mL 128.0/85mm	Greiner Bio-one	780278
Agar	Formedium	AGA03
Ampicillin	Formedium	69-52-3
bromophenol blue	Sigma	BO126-25G
CaCl2	Merck	1.02382.0500
Camera	Qimaging	q30548
Cholesterol	Amresco	0433-250G
Confocal	Leica	DM5500
Filter (0.22 µm)	Sigma	SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope	Leica	MZ165FC
Glycerol	Frutarom	2355519000024
IPTG	Formedium	367-93-1
KCl	Merck	104936
KH2PO4	Merck	1.04873.1000
KOH	Bio-Lab	001649029100
MgSO4	Fisher	22189-08-8	Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody	Hybridoma Bank	5-6
Na2HPO4·7H2O	Sigma	s-0751
NaCl	Bio-Lab	001903029100
Peptone	Merck	61930705001730
Plate pouring pump	Integra	does it p920
RNAi Chaperone library	NA	NA
SDS	VWR Life Science	0837-500
ß-mercaptoethanol	Bio world	41300000-1
stereomicroscope	Leica	MZ6
Tetracycline	Duchefa Biochemie	64-75-5
Tris	Bio-Lab	002009239100
Tween-20	Fisher	BP337-500