Verwendung von Caenorhabditis elegans zum Screening auf gewebespezifische Chaperon-Interaktionen
Summary
Um Chaperon-Chaperon- und Chaperon-Substrat-Interaktionen zu untersuchen, führen wir synthetische Interaktionsscreens bei Caenorhabditis elegans mit RNA-Interferenz in Kombination mit leichten Mutationen oder Überexpression von Chaperonen durch und überwachen gewebespezifische Proteindysfunktion auf organismischer Ebene.
Abstract
Die korrekte Faltung und Montage von Proteinen und Proteinkomplexen ist für die Zellfunktion unerlässlich. Zellen verwenden Qualitätskontrollwege, die beschädigte Proteine korrigieren, sequestrieren oder eliminieren, um ein gesundes Proteom zu erhalten, wodurch die zelluläre Proteostase sichergestellt und weitere Proteinschäden verhindert werden. Aufgrund redundanter Funktionen innerhalb des Proteostase-Netzwerks führt das Screening auf nachweisbare Phänotypen mittels Knockdown oder Mutationen in Chaperon-kodierenden Genen im Vielzellorganismus Caenorhabditis elegans in den meisten Fällen zum Nachweis von geringfügigen oder keinen Phänotypen. Wir haben eine gezielte Screening-Strategie entwickelt, um Chaperone zu identifizieren, die für eine bestimmte Funktion benötigt werden, und so die Lücke zwischen Phänotyp und Funktion zu schließen. Insbesondere überwachen wir neuartige Chaperon-Interaktionen mit RNAi-synthetischen Interaktionsbildschirmen, die die Chaperonexpression nacheinander bei Tieren niederschlagen, die eine Mutation in einem Chaperon-kodierenden Gen tragen oder ein Chaperon von Interesse überexpressieren. Indem wir zwei Chaperone stören, die einzeln keinen groben Phänotyp aufweisen, können wir Chaperone identifizieren, die einen bestimmten Phänotyp verschlimmern oder freilegen, wenn beide gestört sind. Wir zeigen, dass dieser Ansatz bestimmte Gruppen von Chaperonen identifizieren kann, die zusammen funktionieren, um die Faltung eines Proteins oder von Proteinkomplexen zu modulieren, die mit einem bestimmten Phänotyp assoziiert sind.
Introduction
Zellen bewältigen Proteinschäden durch den Einsatz von Qualitätskontrollmaschinen, die beschädigte Proteine reparieren, sequestrieren oder entfernen1,2. Die Faltung und Montage von Proteinkomplexen wird durch molekulare Chaperone unterstützt, eine vielfältige Gruppe hochkonservierter Proteine, die beschädigte Proteine reparieren oder sequestrieren können3,4,5,6,7. Die Entfernung geschädigter Proteine wird durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS)8 oder durch die Autophagie-Maschinerie9 in Zusammenarbeit mit den Chaperonen10,11,12vermittelt. Die Protein-Homöostase (Proteostase) wird daher durch Qualitätskontrollnetzwerke aufrechterhalten, die aus Falt- und Abbaumaschinen bestehen3,13. Die Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Komponenten des Proteostase-Netzwerks in vivo zu verstehen, ist jedoch eine große Herausforderung. Während Protein-Protein-Interaktionsscreens wichtige Informationen über physikalische Interaktionen und Chaperonkomplexe14,15beisteuern, fehlt es an einem Verständnis der Organisation und der kompensatorischen Mechanismen innerhalb gewebespezifischer Chaperonnetzwerke in vivo.
Genetische Interaktionen werden oft als leistungsfähiges Werkzeug verwendet, um die Beziehung zwischen Genpaaren zu untersuchen, die an gemeinsamen oder kompensatorischen biologischen Signalwegen beteiligt sind16,17,18. Solche Beziehungen können gemessen werden, indem Mutationspaare kombiniert und der Einfluss einer Mutation in einem Gen auf den phänotypischen Schweregrad, der durch eine Mutation im zweiten Gen verursacht wird, quantifiziertwird 16. Während die meisten dieser Kombinationen keine Wirkung in Bezug auf den Phänotyp zeigen, können einige genetische Interaktionen die Schwere des gemessenen Phänotyps entweder verschlimmern oder lindern. Erschwerende Mutationen werden beobachtet, wenn der Phänotyp der Doppelslektionsmutante schwerwiegender ist als der erwartete Phänotyp, der bei der Kombination der einzelnen Deletionsmutanten beobachtet wird, was bedeutet, dass die beiden Gene in parallelen Signalwegen funktionieren und zusammen eine bestimmte Funktion beeinflussen. Im Gegensatz dazu werden lindernde Mutationen beobachtet, wenn der Phänotyp der Doppelsleerationsmutante weniger schwerwiegend ist als der Phänotyp, der bei den Einzelnen Deletionsmutanten beobachtet wurde, was bedeutet, dass die beiden Gene zusammen als Komplex wirken oder am gleichen Weg teilnehmen16,18. Dementsprechend wurden verschiedene Phänotypen, die quantifiziert werden können, einschließlich breiter Phänotypen wie Letalität, Wachstumsraten und Brutgröße, sowie spezifischer Phänotypen wie Transkriptionsreporter verwendet, um genetische Interaktionen zu identifizieren. Zum Beispiel stützten sich Jonikas et al. auf einen ER-Stressreporter, um die Interaktionen des Saccharomyces cerevisiae ER entfalteten Proteinantwort-Proteostase-Netzwerks mit paarweisen Gen-Deletionsanalysen zu untersuchen19.
Genetische Interaktionsscreens beinhalten die systematische Kreuzung paarweiser Deletionsmutationen, um einen umfassenden Satz von Doppelmutanten zu erzeugen20. In Tiermodellen und speziell bei C. elegansist dieser groß angelegte Ansatz jedoch nicht durchführbar. Stattdessen können mutierte Stämme auf ihre genetischen Interaktionsmuster getestet werden, indem die Genexpression mithilfe von RNA-Interferenz (RNAi) herunterreguliert wird21. C. elegans ist ein leistungsfähiges System für Bildschirme auf Basis von RNAi22,23. Bei C. eleganswird die doppelsträngige RNA-Abgabe (dsRNA) durch bakterielle Fütterung erreicht, was zur Ausbreitung von dsRNA-Molekülen auf zahlreiche Gewebe führt. Auf diese Weise wirken die eingebrachten dsRNA-Moleküle über ein schnelles und einfaches Verfahren auf das Tier21. Ein genetisches Interaktionsscreening mit RNAi kann daher die Auswirkungen der Downregulierung einer Reihe von Genen oder der meisten C. elegans-kodierenden Gene unter Verwendung von RNAi-Bibliothekenaufdecken 24. In einem solchen Bildschirm sind Treffer, die das Verhalten der mutanten von Interesse beeinflussen, aber nicht des Wildtypstamms, potenzielle Modifikatoren des zu überwachenden Phänotyps25. Hier wenden wir eine Kombination aus Mutationen und RNAi-Screening an, um gewebespezifische Chaperon-Interaktionen bei C. elegans systematisch abzubilden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein integriertes Bild des Proteostase-Netzwerks, das widerspiegelt, wie es in verschiedenen Metazoenzellen und -geweben organisiert ist und funktioniert, fehlt weiterhin. Um dieses Manko zu beheben, sind spezifische Informationen über die Wechselwirkungen verschiedener Komponenten dieses Netzwerks, wie z.B. molekulare Chaperone, in bestimmten Geweben im Laufe der Entwicklung und Alterung erforderlich. Hier zeigten wir, wie die Verwendung von gewebespezifischen Störungen es uns ermöglichte, das Chaperonnetzwerk in eine…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Caenorhabditis Genetics Center, das vom NIH National Center for Research Resources (NCRR) finanziert wird, für einige der Nematodenstämme. Monoklonale Antikörper, die von H.F. Epstein entwickelt wurden, wurden aus der Developmental Studies Hybridoma Bank gewonnen, die unter der Schirmherrschaft des NICHD entwickelt und vom Department of Biology der University of Iowa gepflegt wurde. Diese Forschung wurde durch ein Stipendium der Israel Science Foundation (Stipendium Nr. 278/18) und durch ein Stipendium des israelischen Ministeriums für Wissenschaft und Technologie und des Ministeriums für auswärtige Angelegenheiten und internationale Zusammenarbeit, Generaldirektion für Länderförderung, Italienische Republik (Zuschuss Nr. 3-14337) unterstützt. Wir danken den Mitgliedern des Ben-Zvi-Labors für die Hilfe bei der Vorbereitung dieses Manuskripts.
Materials
| 12-well-plates | SPL | BA3D16B | |
| 40 mm plates | Greiner Bio-one | 627160 | |
| 60 mm plates | Greiner Bio-one | 628102 | |
| 6-well plates | Thermo Scientific | 140675 | |
| 96 well 2 mL 128.0/85mm | Greiner Bio-one | 780278 | |
| Agar | Formedium | AGA03 | |
| Ampicillin | Formedium | 69-52-3 | |
| bromophenol blue | Sigma | BO126-25G | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | |
| Camera | Qimaging | q30548 | |
| Cholesterol | Amresco | 0433-250G | |
| Confocal | Leica | DM5500 | |
| Filter (0.22 µm) | Sigma | SCGPUO2RE | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ165FC | |
| Glycerol | Frutarom | 2355519000024 | |
| IPTG | Formedium | 367-93-1 | |
| KCl | Merck | 104936 | |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873.1000 | |
| KOH | Bio-Lab | 001649029100 | |
| MgSO4 | Fisher | 22189-08-8 | Gift from the Morimoto laboratory |
| Myosin MHC A (MYO-3) antibody | Hybridoma Bank | 5-6 | |
| Na2HPO4·7H2O | Sigma | s-0751 | |
| NaCl | Bio-Lab | 001903029100 | |
| Peptone | Merck | 61930705001730 | |
| Plate pouring pump | Integra | does it p920 | |
| RNAi Chaperone library | NA | NA | |
| SDS | VWR Life Science | 0837-500 | |
| ß-mercaptoethanol | Bio world | 41300000-1 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Tetracycline | Duchefa Biochemie | 64-75-5 | |
| Tris | Bio-Lab | 002009239100 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 |
References
- Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
- Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
- Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
- Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J. The HSP90 chaperone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 345-360 (2017).
- Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
- Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B. The Hsp70 chaperone network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
- Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
- Bett, J. S. Proteostasis regulation by the ubiquitin system. Essays in Biochemistry. 60 (2), 143-151 (2016).
- Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
- Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
- Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
- Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
- O’Brien, D., van Oosten-Hawle, P. Regulation of cell-non-autonomous proteostasis in metazoans. Essays in Biochemistry. 60 (2), 133-142 (2016).
- Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
- Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
- Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
- Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
- Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
- Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
- Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
- Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
- Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
- Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21 (2014).
- Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
- Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891 (2019).
- Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
- Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
- Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644 (2013).
- Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
- Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
- Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
- Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
- Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
- Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
- Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
- Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485 (2011).
- Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
- Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531 (2016).
- Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
- Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921 (2013).
- Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
- Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
- Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
- Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
- Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
- Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
- Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
- Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218 (2013).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
- Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
- Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
- Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
- Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
- Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).
