Transposon Insertion Libraries genereren in gram-negatieve bacteriën voor high-throughput sequencing

Summary

We beschrijven een methode om verzadigende transposon mutantbibliotheken te genereren in gramnegatieve bacteriën en de daaropvolgende voorbereiding van DNA-ampliconbibliotheken voor hoge doorvoersequenties. Als voorbeeld richten we ons op de ESKAPE-ziekteverwekker, Acinetobacter baumannii,maar dit protocol is vatbaar voor een breed scala aan gramnegatieve organismen.

Abstract

Transposon sequencing (Tn-seq) is een krachtige methode die transposon mutagenesis en massieve parallelle sequencing combineert om genen en paden te identificeren die bijdragen aan bacteriële fitness onder een breed scala van omgevingsomstandigheden. Tn-seq toepassingen zijn uitgebreid en hebben niet alleen het onderzoek van genotype-fenotype relaties op organisme niveau, maar ook op de bevolking, gemeenschap en systemen niveaus. Gram-negatieve bacteriën zijn sterk geassocieerd met antimicrobiële resistentie fenotypes, die incidenten van antibiotica behandeling falen heeft verhoogd. Antimicrobiële resistentie wordt gedefinieerd als bacteriële groei in de aanwezigheid van anders dodelijke antibiotica. De “last-line” antimicrobiële colistin wordt gebruikt voor de behandeling van gram-negatieve bacteriële infecties. Echter, verschillende Gram-negatieve ziekteverwekkers, waaronder Acinetobacter baumannii kan ontwikkelen colistine resistentie door middel van een reeks van moleculaire mechanismen, waarvan sommige werden gekenmerkt met behulp van Tn-seq. Bovendien, signaal transductie trajecten die colistin resistentie reguleren variëren binnen Gram-negatieve bacteriën. Hier stellen we een efficiënte methode voor om mutagenesis in A. baumannii te transtreren die de generatie van een verzadigende transposon insertiebibliotheek en amplicon bibliotheekbouw stroomlijnt door de noodzaak van beperkingsenzymen, adapterligatie en gelzuivering te elimineren. De hierin beschreven methoden maken een diepgaande analyse mogelijk van moleculaire determinanten die bijdragen aan A. baumannii-geschiktheid wanneer ze worden uitgedaagd met colistine. Het protocol is ook van toepassing op andere Gram-negatieve ESKAPE-pathogenen, die. voornamelijk geassocieerd worden met resistente ziekenhuisinfecties.

Introduction

De ontdekking van antibiotica is ongetwijfeld een van de meest impactvolle gezondheidsgerelateerde gebeurtenissen van de^20e eeuw. Niet alleen antibiotica snel oplossen ernstige bacteriële infecties, ze spelen ook een centrale rol in de moderne geneeskunde. Grote operaties, transplantaties en vooruitgang in de neonatale geneeskunde en chemotherapie verlaten patiënten die vatbaar zijn voor levensbedreigende infecties en deze therapieën zouden niet mogelijk zijn zonder antibiotica^1,2. De snelle ontwikkeling en verspreiding van antibioticaresistentie onder menselijke pathogenen heeft echter de werkzaamheid van alle klinisch belangrijke klassen van antibiotica aanzienlijk verminderd³. Veel bacteriële infecties die ooit gemakkelijk werden gewist met antibiotica behandeling, niet langer reageren op klassieke behandeling protocollen, waardoor een ernstige bedreiging voor de wereldwijde volksgezondheid¹. Antimicrobiële resistentie (AMR) is waar bacteriële cellen groeien in anders dodelijke concentraties van antibiotica, ongeacht de behandelingsduur^4,5. Er is een dringende noodzaak om moleculaire en biochemische factoren te begrijpen die AMR reguleren, wat zal helpen bij het begeleiden van alternatieve antimicrobiële ontwikkeling. Specifiek, ESKAPE pathogenen zijn problematisch in klinische omgevingen en geassocieerd met uitgebreide AMR. Deze omvatten Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa en Enterobacter spp. Hoewel verschillende mechanismen bijdragen aan AMR in ESKAPE-pathogenen, zijn de laatste vier organismen gramneg negatief.

Gram-negatieve bacteriën monteren een bepalend buitenste membraan dat hen beschermt tegen ongunstige omgevingsomstandigheden. Het buitenste membraan dient als een doorlaatbaarheidsbarrière om de toegang van giftige moleculen, zoals antibiotica, in de cel te beperken. In tegenstelling tot andere biologische membranen is het buitenste membraan asymmetrisch. De buitenste bijsluiter is verrijkt met aan de oppervlakte blootgestelde lipopolysaccharide, terwijl de binnenste bijsluiter een mengsel is van fosfolipiden⁶. Lipopolysaccharide moleculen zijn verankerd aan het buitenste membraan door een geconserveerde lipide A moiety ingebed in de lipide bilayer⁷. Het canonieke lipide A-domein van Escherichia coli lipopolysaccharide is vereist voor de groei van de meeste Gram-negatieve bacteriën en wordt gesynthetiseerd door een negen-staps enzymatische route die een van de meest fundamentele en geconserveerde trajecten in Gram-negatieve organismen^6,7,8is .

Polymyxinen zijn kationische antimicrobiële peptiden die zich richten op de lipide A domein van lipopolysaccharide om het buitenste membraan te verstoren en lyse de cel. De elektrostatische interactie tussen positief geladen residuen van polymyxinen en de negatief geladen lipide A-fosfaatgroepen verstoren het bacteriële celmembraan uiteindelijk tot celdood^{9,10,11,12,13}. Colistine (polymyxine E) is een antimicrobiële in laatste instantie die wordt gebruikt voor de behandeling van infecties veroorzaakt door multiresistente gramnagende nosocomiale pathogenen, zoals Acinetobacter baumannii^14,15,16. Voor het eerst ontdekt in 1947, polymyxinen worden geproduceerd door de bodembacteriën, Paenibacillus polymyxa^17,18,19. Polymyxinen werden voorgeschreven om gram-negatieve infecties te behandelen voor de jaren voordat hun klinisch gebruik werd beperkt als gevolg van meldingen van significante nephro- en neurotoxiciteit^20,21.

A. baumannii is een nosocomiale gramnegatieve ziekteverwekker die de morbiditeit en mortaliteit van de patiëntresultaten in de afgelopen decennia drastisch heeft verhoogd²². Wat ooit werd beschouwd als een ziekteverwekker met een lage dreiging, vormt nu een aanzienlijk risico voor ziekenhuisinfecties over de hele wereld vanwege zijn ongelooflijke vermogen om AMR te verwerven en een hoog risico op^{epidemie 23,24}. A. baumannii is goed voor meer dan 10% van de nosocomiale infecties in de Verenigde Staten. Ziekte manifesteert zich als longontsteking, bacteremie, urineweginfecties, huid- en weke delen infecties, meningitis, en endocarditis²⁵. Behandelingsopties voor A. baumannii-infecties zijn afgenomen als gevolg van resistentie tegen bijna alle antibioticaklassen, waaronder β-lactams, fluoroquinolonen, tetracycline en aminoglycosides^23,24. De prevalentie van multiresistente, langdurig resistente en panresistente A. baumannii isolaten heeft geleid tot een opleving in de colistine behandeling, waarvan werd gedacht dat het een van de weinige overgebleven therapeutische opties nog steeds effectief tegen multidrug resistente A. baumannii. De toegenomen colistineresistentie onder A. baumannii-isolaten heeft echter zijn bedreiging voor de mondiale volksgezondheid verder versterkt¹⁰,^{11,,12,13,27,30,31}.

Recente vooruitgang in high-throughput sequencing technologieën, zoals transposon sequencing (Tn-seq), hebben belangrijke instrumenten om ons begrip van bacteriële fitness in vitro en in vivote bevorderen. Tn-seq is een krachtig hulpmiddel dat kan worden ingezet om genotype-fenotype interacties in bacteriën te bestuderen. Tn-seq is breed toepasbaar voor bacteriële pathogenen, waarbij het traditionele transposon mutagenesis combineert met massieve parallelle sequencing om snel invoegingsplaatsen in kaart te brengen, die kunnen worden gebruikt om DNA-mutaties te koppelen aan fenotypische varianten op een genoombrede schaal^32,33,34,35. Hoewel transposon mutagenesis methoden zijn eerder beschreven, de algemene stappen zijn vergelijkbaar³³. Ten eerste wordt een invoegbibliotheek gegenereerd met behulp van transposon mutagenesis, waarbij elke bacteriële cel binnen een populatie beperkt is tot één transposon invoeging binnen het genomische DNA (gDNA). Na mutagenesis worden individuele mutanten samengevoegd. gDNA wordt gewonnen uit de invoegpot en de transposon-knooppunten worden versterkt en onderworpen aan hoge doorvoersequencing. De reads vertegenwoordigen invoegplaatsen, die in kaart kunnen worden gebracht aan het genoom. Transposon inserties die de conditie te verminderen snel uit de bevolking vallen, terwijl gunstige toevoegingen zijn verrijkt. Tn-seq is instrumenteel geweest om ons begrip van hoe genen bacteriële fitness beïnvloeden in stress³³te bevorderen.

Het Himar1 mariner transposon systeem gecodeerd in pJNW684 werd specifiek gebouwd en geoptimaliseerd voor de omzetting van mutagenesis. Het omvat een mariner-familietransposon flankeren van de kanamycine resistentie gen, die wordt gebruikt voor de selectie van transposon insertion mutanten in A. baumannii. Het codeert ook een A. baumannii specifieke promotor die de expressie van de transposase codering gen³⁶drives . De op zeeherengebaseerde transposon bevat ook twee translationele terminators stroomafwaarts van het kanamycine resistentiegen, dat lees-door stroomafwaarts van de invoeging³⁷voorkomt. pJNW684 draagt ook een RP4/oriT/oriR6K-voorwaardelijke oorsprong van replicatie die vereist dat het λpir-gen dat door de donorstam wordt bijgedragen, zich vermenigvuldigt³⁸. Bij afwezigheid van het λpir-gen zal de pJNW684-vector die de omzettingsmachine draagt, zich niet kunnen vermenigvuldigen in de A. baumannii-ontvangerstam ^10,36,38. Daarom wordt tijdens bacteriële vervoeging alleen het transposon in het ontvangende genoom ingebracht zonder achtergrondinbrengen van het plasmide, dat het transposasegen draagt. Dit is belangrijk omdat het verlies van transposase activiteit samen met de plasmide resulteert in een enkele, stabiele omzetting gebeurtenis die voorkomt dat de transposon zich naar verschillende locaties zodra het invoegt in de ontvanger genoom.

pJNW648 is ook getest op activiteit in een ander Gram-negatief organisme, E. coli. Succesvolle assemblage van een verzadigende Tn-seq bibliotheek in E. coli stam W3110 gaf aan dat het systeem vatbaar is om mutagenese uit te voeren in een breed scala van ziekteverwekkers, waaronder Enterobacteriaceae. Bovendien kan de A. baumannii-specifieke promotor die de omzettingsexpressie stimuleert, snel worden uitgewisseld met een soortspecifieke promotor. Ten slotte kan het kanamycineresistentiegen worden ingeruild voor andere weerstandscassettes, afhankelijk van het AMR-fenotype van het onderzochte organisme.

Een factor die bijdraagt aan de resistentie van colistine in A. baumannii is toediening van onvoldoende doses, waarbij bacteriën worden blootgesteld aan selectieve druk op niet-dodelijke niveaus³⁹. Verschillende rapporten toonden aan dat subinhibitory antimicrobiële concentraties gereguleerde reacties kunnen veroorzaken die de celfysiologie veranderen om de gevoeligheid van de gehele bacteriële populatie te verminderen^11,12,30,31. Met behulp van Tn-seq ontdekten we factoren die de colistineresistentie in A. baumannii-stam ATCC 17978 reguleren na blootstelling aan remmende^10- en subinhibitorische concentraties van colistine. In dit voorbeeld wordt een Tn-seq-methode beschreven die de constructie en verrijking van een verzadigde transposon mutantbibliotheek stroomlijnt met behulp van de op marinergebaseerde familie van transposons^40,41. Terwijl verschillende Tn-seq protocollen genereren 20.000 – 100.000 mutanten^{35,42,43,44,45,46}, kan het hierin beschreven protocol snel een transposon bibliotheek van 400.000 + mutanten genereren, die ruwweg gelijk staat aan een transposon inbrengen elke 10-base paren in A. baumannii¹⁰. Bovendien kan de grootte van de bibliotheek zonder noemenswaardige extra inspanning worden opgeschaald. Deze methode elimineert ook de vereiste voor beperking endonucleases, adapter ligatie en gel zuivering, die de uiteindelijke bibliotheek diversiteit kan verminderen.

Protocol

1. Preparaat van bacteriële stammen Streep de “donor” stam (E. coli MFD DAP-/pJNW684, Tabel van materialen) voor geïsoleerde kolonies op Luria-Bertani agar aangevuld met 600 μM diaminopimimlic zuur (DAP), 100 mg/L van ampicilline en 25 mg/L kanamycine. Incubeer ‘s nachts bij 37 °C. Met behulp van een enkele geïsoleerde kolonie, inentuleren 50 mL luria bouillon (LB) aangevuld met 600 μM DAP, 100 mg/L van ampicilline en 25 mg/L kanamycine in een 250 mL Erlenmeyer kolf e…

Representative Results

De geschetste methoden beschrijven de generatie van een high-density transposon bibliotheek in A. baumannii stam ATCC 17978 door middel van bacteriële vervoeging met behulp van E. coli MFD DAP-, die de plasmid pJNW684(figuur 4B) repliceert . Het gedetailleerde protocol maakt gebruik van bi-ouderlijke bacteriële vervoeging voor de overdracht van pJNW684 van de E. coli λpir+ donorstam naar de A. baumannii-ontvangerstam. Dit is een ef…

Discussion

A. baumannii is een opkomende bedreiging voor de wereldwijde volksgezondheid als gevolg van de snelle verwerving van AMR tegen “last-line” therapeutica, zoals colistin^{10,11,12,23,24,30,31}. In de afgelopen decennia heeft Tn-seq een cruciale rol gespeeld bij het ophelderen van genotyp…

Materials

10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate	Affymetrix	77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate	Invitrogen	10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker	Promega	PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351029
150mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351058
1X B&W	N/A	N/A	Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid	Alfa Aesar	B2239103	used at 600 µM
2X B&W	N/A	N/A	Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP	N/A	N/A	9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)	Fisher Scientific	BP1760	used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system	BECKMAN COULTER	A63881
BioAnalyzer	Agilent	G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis	Agilent	5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP)	New England Biolabs (NEB)	N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack	Invitrogen	12321D
E.coli MFD Dap-	N/A	N/A	DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol	Fisher Scientific	A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials	Corning	09-761-71
Glass beads	Corning	72684
Glycerol	Fisher Scientific	G33
Inoculating loops	Fisher Scientific	22-363-602	Scraping tool
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906	used at 25 mg/L
LB agar, Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426
LoTE	N/A	N/A	Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer	N/A	N/A	9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.)	Fisher Scientific	BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher Scientific	BP39920	Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33238
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher	Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath	Qsonica Sonicators	Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs (NEB)	S1420S
TE buffer	N/A	N/A	10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)	Promega	PR-M1875