Yüksek İşlem Likör Sıralaması Için Gram-Negatif Bakterilerde Transposon Ekleme Kitaplıkları Oluşturma

Summary

Gram-negatif bakterilerde doymak üzere transpozon mutant kütüphaneleri oluşturmak ve daha sonra yüksek işlemli sıralama için DNA amplicon kütüphanelerinin hazırlanmasını tanımlayan bir yöntem. Örnek olarak, biz ESKAPE patojen, Acinetobacter baumanniiodaklanmak , ama bu protokol Gram-negatif organizmaların geniş bir yelpazede için münasip olduğunu.

Abstract

Transposon sıralama (Tn-seq) çevre koşulları geniş bir yelpazede bakteriyel fitness katkıda genler ve yollar belirlemek için transposon mutagenez ve büyük paralel sıralama birleştiren güçlü bir yöntemdir. Tn-seq uygulamaları geniştir ve sadece bir organizma düzeyinde değil, aynı zamanda nüfus, toplum ve sistem düzeylerinde genotip-fenotip ilişkilerinin incelenmesini sağlamıştır. Gram-negatif bakteriler yüksek antimikrobiyal direnç fenotipler ile ilişkilidir, hangi antibiyotik tedavi yetmezliği olayları artmıştır. Antimikrobiyal direnç aksi takdirde öldürücü antibiyotik varlığında bakteriyel büyüme olarak tanımlanır. “Son hat” antimikrobiyal kolistin Gram-negatif bakteriyel enfeksiyonların tedavisinde kullanılır. Ancak, Acinetobacter baumannii de dahil olmak üzere çeşitli Gram-negatif patojenler, moleküler mekanizmalar bir dizi kolistin direnci gelişebilir, bazıları Tn-seq kullanılarak karakterize edildi. Ayrıca kolistin direncini düzenleyen sinyal iletim yolları Gram-negatif bakteriler içinde farklılık gösterir. Burada, restriksiyon enzimleri, adaptör ligasyonu ve jel saflaştırma ihtiyacını ortadan kaldırarak doygun bir transposon ekleme kütüphanesi ve amplicon kütüphane inşaatı nın neslini kolaylaştıran A. baumannii’de transpozon mutagenezinin etkili bir yöntemini öneriyoruz. Burada açıklanan yöntemler, kolistin ile meydan okunduğunda A. baumannii fitness katkıda moleküler determinantların derinlemesine analizini sağlayacaktır. Protokol aynı zamanda diğer Gram-negatif ESKAPE patojenleri için de geçerlidir, hangi öncelikle ilaca dirençli hastane kaynaklı enfeksiyonlar ileilişkilidir.

Introduction

Antibiyotiklerin keşfi şüphesiz^20. Sadece antibiyotikler hızlı ciddi bakteriyel enfeksiyonları çözmek yok, onlar da modern tıpta önemli bir rol oynamaktadır. Büyük ameliyatlar, nakiller ve yenidoğan tıbbı ve kemoterapi gelişmeler hastaları hayatı tehdit eden enfeksiyonlara duyarlı bırakın ve bu tedaviler antibiyotik olmadan mümkün olmaz^1,2. Ancak, hızlı gelişimi ve insan patojenler arasında antibiyotik direncinin yayılması önemli ölçüde antibiyotik lerin tüm klinik açıdan önemli sınıfların etkinliğini azaltmıştır³. Bir zamanlar kolayca antibiyotik tedavisi ile temizlendi birçok bakteriyel enfeksiyonlar, artık klasik tedavi protokolleri yanıt, küresel halk sağlığı için ciddi bir tehdit neden¹. Antimikrobiyal direnç (AMR) bakteri hücrelerinin antibiyotik aksi takdirde ölümcül konsantrasyonlarda büyümek nerede, ne olursa olsun tedavi süresi^4,5. Alternatif antimikrobiyal gelişime rehberlik edecek olan AMR’yi düzenleyen moleküler ve biyokimyasal faktörleri anlamak için acil bir ihtiyaç vardır. Özellikle, ESKAPE patojenleri klinik ortamlarda sorunlu ve geniş AMR ile ilişkilidir. Bunlar arasında Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa ve Enterobacter spp sayılabilir. ESKAPE patojenlerinde çeşitli mekanizmalar AMR’ye katkıda bulunurken, son dört organizma Gram-negatiftir.

Gram-negatif bakteriler, onları olumsuz çevre koşullarından koruyan tanımlayıcı bir dış zar ı bir araya toplarlar. Dış membran hücreiçine antibiyotik gibi toksik moleküllerin girişini kısıtlamak için bir geçirgenlik bariyeri olarak hizmet vermektedir. Diğer biyolojik zarların aksine dış zar asimetriktir. Dış broşür yüzeye maruz lipopolisakkarit ile zenginleştirilmiştir, iç broşür fosfolipidler karışımı ise⁶. Lipopolisakkarit molekülleri, lipid çift katmanlı^7’niniçine gömülü korunmuş bir lipid a moiety ile dış zara demirlenir. Kanonik lipid Escherichia coli lipopolysaccharide bir etki alanı en Gram-negatif bakterilerin büyümesi için gereklidir ve Gram-negatif organizmaların en temel ve korunmuş yollarından biri olan dokuz adımlı enzimatik yol ile sentezlenir^6,7,8.

Polimiksinler, lipid A etki alanını, dış zarı perturb ve hücre yiyiştirmek için hedef katyonik antimikrobiyal peptidlerdir. Poliksinlerin pozitif yüklü kalıntılar ve negatif yüklü lipid A fosfat grupları arasındaki elektrostatik etkileşim sonuçta hücre ölümüne yol açan bakteri hücre zarını bozabilir^9,10,^11,,12,13. Kolistin (polimiksin E) acinetobacter baumannii^14,,15,16gibi çok ilaca dirençli Gram-negatif nosokomiyal patojenlerin neden olduğu enfeksiyonların tedavisinde kullanılan son çare bir antimikrobiyaldir. İlk keşfedilen 1947, polimiksinler toprak bakterileri tarafından üretilmektedir, Paenibacillus polymyxa^17,18,19. Polimaksisinler, klinik kullanımları önemli nefro- ve nörotoksisite raporları nedeniyle sınırlı önce yıllarca Gram-negatif enfeksiyonları tedavi etmek için reçete edildi^20,21.

A. baumannii son yıllarda hasta sonuçlarının morbidite ve mortalitesini önemli ölçüde artıran nosokomiyal Gram-negatif patojendir²². Ne bir zamanlar düşük tehdit patojen olarak kabul edildi, şimdi amr ve salgın yüksek risk elde etmek için inanılmaz yeteneği nedeniyle dünya çapında hastane kaynaklı enfeksiyon için önemli bir risk teşkil^23,24. A. baumannii Amerika Birleşik Devletleri’nde nosokomiyal enfeksiyonların% 10’dan fazla hesapları. Hastalık pnömoni, bakteriyemi, idrar yolu enfeksiyonları, deri ve yumuşak doku enfeksiyonları, menenjit ve endokardit²⁵olarak kendini gösterir. A. baumannii enfeksiyonları için tedavi seçenekleri β-laktamlar, florokinolonlar, tetrasiklin ve aminoglikozitler 23 dahil olmak üzere hemen hemen tüm antibiyotik sınıflarına karşı direnç nedeniyle azalmıştır ,^,24.²³ Çoklu ilaca dirençli, yaygın ilaca dirençli ve pan-ilaca dirençli A. baumannii izole prevalansı kolistin tedavisinde bir canlanma yol açmıştır, hangi hala çok ilaca dirençli A. baumanniikarşı etkili kalan birkaç tedavi seçeneklerinden biri olduğu düşünülmektedir . Ancak, A. baumannii izole arasında artan kolistin direnci daha da^,küresel halk sağlığı^10,11,^{12,,13,27,30,31}için tehdit güçlendirdi .

Transposon sıralama (Tn-seq) gibi yüksek iş letme teknolojisindeki son gelişmeler, in vitro ve in vivobakteriyel fitness anlayışımızı ilerletmek için önemli araçlar sağlamıştır. Tn-seq bakterilerde genotip-fenotip etkileşimleri çalışma için kaldıraçlı olabilir güçlü bir araçtır. Tn-seq bakteriyel patojenler arasında geniş uygulanabilir, bu hızla ekleme siteleri harita için büyük paralel sıralama ile geleneksel transposon mutagenezi birleştirir, hangi bir genom çapında ölçekte henotypic varyantları DNA mutasyonları bağlamak için kullanılabilir^32,33,34,35. Transpozon mutagenez yöntemleri daha önce tanımlanmış olsa da, genel adımlar benzer³³. İlk olarak, bir ekleme kitaplığı transposon mutagenez kullanılarak oluşturulur, burada bir popülasyon içindeki her bakteri hücresi genomik DNA (gDNA) içinde tek bir transpozon ekleme ile sınırlıdır. Mutagenezi takiben, bireysel mutantlar bir araya gelir. gDNA ekleme mutant havuzundan çıkarılır ve transposon kavşakları yükseltilir ve yüksek işlem lisekite tabi tutulur. Okumalar, genoma eşlenen ekleme sitelerini temsil eder. Fitness azaltmak Transposon eklemeler hızla nüfus tan dışarı düşmek, yararlı eklemeler zenginleştirilmiş ise. Tn-seq genlerin stres³³bakteriyel fitness nasıl etkilediğini anlayışımızı ilerletmek için etkili olmuştur.

PJNW684 kodlu Himar1 mariner transposon sistemi özel olarak inşa edilmiş ve transposon mutagenezi amacıyla optimize edilmiştir. A. baumannii’de transposon ekleme mutantlarının seçiminde kullanılan kanamisin direnci genini çevreleyen bir denizci-aile transposon içerir. Ayrıca transposaz kodlama geni³⁶ekspresyonu sürücüler bir A. baumannii özel organizatörü kodlar. Marinertabanlı transposon da ekleme³⁷okuma yoluyla engeller kanamisin direnç geni, iki çeviri terminatörleri içerir. pJNW684 ayrıca^38’içoğaltmak için donör ünyatının katkıda bulunduğu λpir geni gerektiren bir RP4/oriT/oriR6K-koşullu çoğaltma kaynağı taşır. λpir geninin yokluğunda, transpozisyon mekanizmasını taşıyan pJNW684 vektörü A. baumannii alıcı suşu^{10,36,38’de}çoğalamaz. Bu nedenle, bakteriyel konjugasyon sırasında, sadece transposon transposaz geni taşıyan plazmid, arka plan ekleme olmadan alıcı genom içine yerleştirilir. Bu önemli, çünkü transpozaz aktivitesinin ve plazmidin kaybı, transpozonun alıcı genoma girdikten sonra farklı konumlara taşınmasını engelleyen tek ve kararlı transpozisyon olayıyla sonuçlanır.

pJNW648 de başka bir Gram-negatif organizma, E. coliaktivite için test edilmiştir. E. coli suş W3110 bir doymak Tn-seq kütüphane başarılı montaj sistemin enterobacteriaceae dahil patojenler geniş bir yelpazede mutagenez gerçekleştirmek için münasip olduğunu belirtti. Ayrıca, transposaz ekspresyonu yönlendiren A. baumannii özel organizatörü hızla türe özgü bir promotör ile değiştirilebilir. Son olarak, kanamisin direnç geni, çalışılan organizmanın AMR fenotipine bağlı olarak diğer direnç kasetleri ile değiştirilebilir.

A. baumannii kolistin direncine katkıda bulunan bir faktör yetersiz dozların uygulanmasıdır, bakterilerin öldürücü olmayan seviyelerde seçici basınca maruz kaldığı³⁹. Çeşitli raporlar subinhibitory antimikrobiyal konsantrasyonları tüm bakteri popülasyonunun duyarlılığını azaltmak için hücre fizyolojisi değiştirmek düzenlenmiş yanıtları neden olabilir gösterdi^11,12,30,31. Tn-seq kullanarak, a. baumannii zorlanma ATCC 17978’de kolistin direncini düzenleyen¹⁰ faktörler keşfettik. Bu örnekte, 40,^{40,41, 41,}mariner tabanlı transposon ailesi kullanılarak doymuş transposon mutant kütüphanesinin inşası ve zenginleşmesini kolaylaştıran bir Tn-seq yöntemi ayrıntıları. Birkaç Tn-seq protokolleri oluşturmak iken 20,000 – 100,000 mutantlar^{35,42,43,44,45,46}, burada açıklanan protokol hızla 400.000 + mutantlar bir transposon kütüphane oluşturabilir, kabaca Bir transposon ekleme her 10-baz çiftleri eşittir.¹⁰ Ayrıca, kitaplık boyutu önemli bir ek çaba olmadan ölçeklendirilebilir. Bu yöntem aynı zamanda son kütüphane çeşitliliğini azaltabilen kısıtlama endonükleazları, bağdaştırıcı ligasyonu ve jel arınması gereksinimini de ortadan kaldırır.

Protocol

1. Bakteriyel suş hazırlığı Çizgi “donör” suşu(E. coli MFD DAP-/pJNW684, Tablo Malzemeler) Luria-Bertani agar üzerinde izole koloniler için 600 μM diaminopimelik asit ile takviye (DAP), 100 mg / L ampisilin ve kanamisin 25 mg / L. Bir gecede 37 °C’de kuluçkaya yatırın. Tek bir izole koloni kullanarak, 600 μM DAP, 100 mg/L ampisilin ve 25 mg/L kanamisin içeren 50 mL Luria suyu (LB) 250 mL Erlenmeyer şişesinde inoküle edin ve “donör” olarak etiketlendi.</…

Representative Results

Özetlenen yöntemler E. coli MFD DAP kullanarak bakteriyel konjugasyon yoluyla A. baumannii suşu ATCC 17978 bir yüksek yoğunluklu transposon kütüphane nin nesil açıklar-plazmid pJNW684 çoğaltır (Şekil 4B). Ayrıntılı protokol, pJNW684’ün E. coli λpir+ donör süzmesinden A. baumannii alıcıya transferi için iki ebeveynli bakteriyel konjugasyon unu kullanır. Bu yoğun transpozon mutant kütüphaneleri oluşturmak içi…

Discussion

A. baumannii kolistin^,10 ,¹¹,^12,2310,,24,^30,31gibi “son satır” terapötikkarşı AMR hızlı edinimi nedeniyle küresel halk sağlığı için ortaya çıkan bir^tehdittir. Son yıllarda, Tn-seq çok sayıda bakteri türleri arasında genotip-fenotip etkileşimleri açıklığa kavu…

Materials

10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate	Affymetrix	77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate	Invitrogen	10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker	Promega	PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351029
150mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351058
1X B&W	N/A	N/A	Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid	Alfa Aesar	B2239103	used at 600 µM
2X B&W	N/A	N/A	Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP	N/A	N/A	9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)	Fisher Scientific	BP1760	used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system	BECKMAN COULTER	A63881
BioAnalyzer	Agilent	G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis	Agilent	5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP)	New England Biolabs (NEB)	N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack	Invitrogen	12321D
E.coli MFD Dap-	N/A	N/A	DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol	Fisher Scientific	A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials	Corning	09-761-71
Glass beads	Corning	72684
Glycerol	Fisher Scientific	G33
Inoculating loops	Fisher Scientific	22-363-602	Scraping tool
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906	used at 25 mg/L
LB agar, Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426
LoTE	N/A	N/A	Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer	N/A	N/A	9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.)	Fisher Scientific	BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher Scientific	BP39920	Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33238
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher	Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath	Qsonica Sonicators	Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs (NEB)	S1420S
TE buffer	N/A	N/A	10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)	Promega	PR-M1875