高スループットシーケンシングのためのグラム陰性細菌におけるトランスポゾン挿入ライブラリの生成

Summary

Gram陰性細菌における飽和トランスポゾン変異ライブラリーの生成方法と、その後のDNAアンプリコンライブラリーのハイスループットシーケンシングの調製方法について述べる。一例として、ESKAPE病原体 であるアシネトバクターバウマンニーに焦点を当てていますが、このプロトコルは広範囲のグラム陰性生物に適しています。

Abstract

トランスポゾンシーケンシング(Tn-seq)は、トランスポゾン突然変異誘発と大規模な並列シーケンシングを組み合わせて、幅広い環境条件下で細菌の適合性に寄与する遺伝子や経路を同定する強力な方法です。Tn-seqアプリケーションは広範囲に及び、生物レベルでの遺伝子型-表現型関係の検査を可能にしているだけでなく、集団、コミュニティ、システムレベルでも可能にしています。グラム陰性細菌は抗菌性のフェノタイプと高く関連しており、抗生物質治療の失敗の発生が増加しています。抗菌性は、それ以外の場合は致死的な抗生物質の存在下で細菌の増殖として定義される。「最終線」抗菌コリスチンは、グラム陰性細菌感染を治療するために使用される。しかし、 アシネトバクターバウマンニ を含むいくつかのグラム陰性病原体は、さまざまな分子機構を介してコリスチン耐性を発症し、その一部はTn-seqを用いて特徴付けられる。さらに、コリスチン耐性を調節するシグナル伝達経路は、グラム陰性菌内で変化する。ここでは、制限酵素、アダプターライゲーション、ゲル精製の必要性を排除することにより、飽和トランスポゾン挿入ライブラリとアンプリコンライブラリ構築の生成を合理化する A.バウマンニー におけるトランスポゾン突然変異誘発の効率的な方法を提案する。本明細書に記載されている方法は、コリスチンに挑戦したときに A.バウマンニの 適合性に寄与する分子決定因子の詳細な分析を可能にする。このプロトコルは、主に薬剤耐性病院で感染した感染症に関連する他のグラム陰性ESKAPE病原体にも適用可能である。

Introduction

抗生物質の発見は間違いなく20^世紀の最も影響を与える健康関連の出来事の一つです。抗生物質は重篤な細菌感染を迅速に解決するだけでなく、現代医学においても極めて重要な役割を果たします。新生児医学と化学療法の主要な手術、移植および進歩は患者を生命を脅かす感染症の影響を受けやすくし、これらの療法は抗生物質^11、22なしでは不可能であろう。しかし、ヒト病原体間での抗生物質耐性の急速な発達と普及は、すべての臨床的に重要なクラスの抗生物質の有効性を有意に低下させた^3。かつて抗生物質治療で容易にクリアされた多くの細菌感染は、もはや古典的な治療プロトコルに反応しなくなり、世界的な公衆衛生に深刻な脅威を引き起こす^1.抗菌性(AMR)は、治療期間^44、55に関係なく、抗生物質の致死濃度以外の場合に細菌細胞が増殖する場所である。AMRを調節する分子および生化学的要因を理解することが緊急に必要であり、代替抗菌性開発の指針となる。具体的には、ESKAPE病原体は臨床現場で問題があり、広範囲なAMRに関連している。これらには、Eンテロコッカス・フェシウム、Sタピロコッカス・アウレウス、Kレブシエラ・ニューモニエ、Aシネトバクター・バウマンニ、P・セウドモナス・エルギノサ、Eンテロバクター属が含まれる。いくつかのメカニズムはESKAPE病原体のAMRに寄与するが、後者の4つの生物はグラム陰性である。

グラム陰性菌は、有害な環境条件からそれらを保護する定義外膜を組み立てます。外膜は、抗生物質などの有毒分子の細胞への侵入を制限する透過性障壁として機能する。他の生体膜とは異なり、外膜は非対称である。外側のリーフレットは表面に露出したリポ多糖類で富化され、一方、内リーフレットはリン脂質⁶の混合物である。リポ多糖類分子は、脂質二重層⁷内に埋め込まれた保存脂質A部分によって外膜に固定される。大腸菌のカノニカル脂質Aドメインは、ほとんどのグラム陰性細菌の増殖に必要であり、グラム陰性生物^{66、7、87,8}において最も基本的かつ保存された経路の1つである9段階の酵素経路によって合成される。

ポリミキシンは、リポ多糖の脂質Aドメインを標的とするカチオ性抗菌ペプチドであり、外膜を摂動し、細胞を分解する。ポリミキシンの正に帯電した残基と負に帯電した脂質Aリン酸基との間の静電相互作用は、最終的に細胞死^{につながる}細菌細胞膜を破壊する^{9,10,,11,,12,,13.}コリスチン(ポリミキシンE)は、多剤耐性グラム陰性ノソコノミアル病原体に起因する感染症を治療するために使用される最後の手段である抗菌薬であり、例えばアシネトバクターバウマンニー¹⁴14、15、16。^,15,16最初に発見された 1947, ポリミキシンは、土壌細菌によって生成されます,パエニバチルスポリミキサ^17,,18,,19.ポリミキシンは、有意な腎および神経毒性^20,21,21の報告のために、臨床的使用が制限される前に、グラム陰性感染症を何年も治療するために処方された。

A. バウマンニは、最近数十年にわたって患者の転帰の罹患率と死亡率を劇的に増加させた院内性のグラム陰性病原体^{である 22}.かつては低脅威病原体と見なされていたものは、AMRを獲得する能力と流行のリスクが高いため、世界中の病院で感染する重大なリスクを引き起こします^。,24A. バウマンニは、米国の経経性感染症の10%以上を占めています。疾患は、肺炎、菌血症、尿路感染症、皮膚および軟部組織感染症、髄膜炎、および心内膜炎²⁵として現れる。A.バウマンニー感染症の治療選択肢は、βラクタム、フルオロキノロン、テトラサイクリン、およびアミノグリコシド^23,24,24を含むほぼすべての抗生物質クラスに対する耐性のために減少している。多剤耐性、広範囲に薬剤耐性および汎薬剤耐性A.バウマンニの分離株の有病率は、コリスチン治療の復活につながっている。しかし、A.バウマンニ分離株間のコリスチン耐性の増加は、^,世界の公衆衛生10、11、12、13、27、30、31に対する脅威をさらに増幅している。^{10,11,12,1327,30,31}

トランスポゾンシーケンシング(Tn-seq)などのハイスループットシーケンシング技術の最近の進歩は、インビトロおよびインビボでの細菌適性の理解を進めるための重要なツールを提供してきました。Tn-seqは細菌の遺伝子型-表現型相互作用を研究するために利用することができる強力な用具である。Tn-seqは細菌病原体全体に広く適用可能であり、従来のトランスポゾン突然変異誘発と大規模な平行シーケンシングを組み合わせて迅速に挿入部位をマッピングし、DNA変異を^,ゲノム全体のスケール32、33、34、35で表皮変異体にリンクするために使用できる。^32,3334,35トランスポゾン変異生成法は既に説明されているが、一般的なステップは³³に類似している。まず、挿入ライブラリはトランスポゾン変異生成を使用して生成され、そこで集団内の各細菌細胞はゲノムDNA(gDNA)内の単一のトランスポゾン挿入に制限される。突然変異誘発の後、個々の突然変異体がプールされる。gDNAは挿入変異体プールから抽出され、トランスポゾン接合部は増幅され、ハイスループットシーケンシングを受けます。読み取りは、ゲノムにマッピングできる挿入部位を表します。適性を減らすトランスポゾン挿入は、有益な挿入が豊かにされている間、すぐに集団から落ちる。Tn-seqは、遺伝子がストレス³³の細菌フィットネスにどのような影響を与えるかについての理解を進めるのに役立っています。

pJNW684でコード化されたHimar1マリナートランスポゾンシステムは、トランスポゾン変異生成の目的のために特別に構築され、最適化されました。カナマイシン耐性遺伝子に隣接するマリナー-ファミリートランスポゾンを含み、A.バウマンニにおけるトランスポゾン挿入変異体の選択に使用される。また、トランスポザーゼコード遺伝子³⁶の発現を駆動するA.バウマンニ特異的プロモーターをコードする。このマリナー系トランスポゾンには、カナマイシン耐性遺伝子の下流に2つのトランスレーショナルターミネーターが含まれており、挿入³⁷の下流に読み込みを防止する。pJNW684はまた^、38を複製するためにドナー株によって寄与するλpir遺伝子を必要とする複製のRP4/oriT/oriR6K条件付き起源を運ぶ。λpir 遺伝子がない場合、転位機械を運ぶpJNW684ベクターは、A.バウマンニ受信者株^{10、36、3836,38}において¹⁰複製することができない。したがって、細菌結合の間に、トランスポゾンのみが、トランスポザーゼ遺伝子を運ぶプラスミドのバックグラウンド挿入なしにレシピエントゲノムに挿入される。これは、トランスポザーゼ活性の喪失がプラスミドと共に、レシピエントゲノムに挿入されるとトランスポゾンが異なる場所に移動するのを妨げる単一の安定した転置イベントをもたらすので、重要です。

pJNW648はまた、別のグラム陰性生物、 大腸菌での活動についてテストされています。 大腸菌 株W3110における飽和Tn-seqライブラリーの組み立て成功は、腸内細菌科を含む幅広い病原体で変異誘発を行うことが可能であることを示した。さらに、トランスポザーゼ発現を駆動する A.バウマンニ 特異的プロモーターは、種特異的プロモーターと迅速に交換することができる。最後に、カナマイシン耐性遺伝子は、研究されている生物のAMR表現型に応じて、他の耐性カセットと交換することができる。

A. バウマンニのコリスチン耐性に寄与する1つの要因は、細菌が非致死レベル³⁹で選択的圧力にさらされる不十分な用量の投与である。いくつかの報告は、抑制性抗菌濃度が、細菌集団全体の感受性を低下させるために細胞生理学を変化させる調節応答を誘導し得ることを示した^{11,,12,30,,31.,}Tn-seqを用いて、阻害性¹⁰およびコリスチンの亜阻害濃度にさらされた後、A.バウマンニ株ATCC 17978におけるコリスチン耐性を調節する因子を発見した。この例では、マリナーベースのトランスポソン^40,41,41ファミリーを使用して飽和トランスポゾン変異ライブラリの構築と濃縮を合理化するTn-seq法を詳述する。いくつかのTn-seqA. baumanniiプロトコルは、20,000 -100,000変異体³⁵35、42、43、44、45、46を生成するが、本明細書に記載されているプロトコルは、400,000+変異体のトランスポゾンライブラリを急速に生成することができ、これはおよそ^{,42,43,44,45,4610}塩基対毎にトランスポゾンに相当する。さらに、ライブラリのサイズは、多大な追加の努力をせずにスケールアップすることができます。この方法はまた、制限エンドヌクレアーゼ、アダプターライゲーションおよびゲル精製の要件を排除し、最終的なライブラリの多様性を減らすことができます。

Protocol

1. 細菌株の調製 600 μMのジアミノピメル酸(DAP)、アンピシリン100mg/L、カンマイシン25mg/Lを補ったルリア・ベルタニ寒天上の孤立したコロニーに対する「ドナー」株(大腸菌 MFD DAP-/pJNW684、 材料表)をストリークする。37°Cで一晩インキュベートする。 単一の単一の単一のコロニーを使用して、600 μM DAP、100 mg/L のアンピシリン、25mg/L のカナマイシンを250 mL のエ…

Representative Results

概説された方法は、プラスミドpJNW684を複製する大腸菌MFD DAP-を用いた細菌結合を介して-A.バウマンニ株ATCC 17978における高密度トランスポゾンライブラリーの生成を記述する(図4B)。詳細なプロトコルは、大腸菌λpir+ドナー株からA.バウマンニレシピエント株へのpJNW684の転送にバイペアの細菌結合を使用する。これは、高密度トラ…

Discussion

A. バウマンニは、コリス^,チン^,,,,10、11、12、23、24、30、31などの「ラストライン」^10,11治療薬に対するAMRの急速な取得による世界的な公衆衛生に対する新たな脅威である。^1223243031ここ数十年、Tn-seqは、多くの細菌…

Materials

10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate	Affymetrix	77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate	Invitrogen	10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker	Promega	PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351029
150mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351058
1X B&W	N/A	N/A	Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid	Alfa Aesar	B2239103	used at 600 µM
2X B&W	N/A	N/A	Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP	N/A	N/A	9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)	Fisher Scientific	BP1760	used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system	BECKMAN COULTER	A63881
BioAnalyzer	Agilent	G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis	Agilent	5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP)	New England Biolabs (NEB)	N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack	Invitrogen	12321D
E.coli MFD Dap-	N/A	N/A	DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol	Fisher Scientific	A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials	Corning	09-761-71
Glass beads	Corning	72684
Glycerol	Fisher Scientific	G33
Inoculating loops	Fisher Scientific	22-363-602	Scraping tool
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906	used at 25 mg/L
LB agar, Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426
LoTE	N/A	N/A	Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer	N/A	N/A	9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.)	Fisher Scientific	BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher Scientific	BP39920	Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33238
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher	Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath	Qsonica Sonicators	Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs (NEB)	S1420S
TE buffer	N/A	N/A	10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)	Promega	PR-M1875