고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에 트랜스포슨 삽입 라이브러리 생성
Summary
당사는 그람 음성 박테리아에 있는 포화 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리를 생성하고 고처리량 시퀀싱을 위한 DNA 증폭기 라이브러리의 후속 준비를 생성하는 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리는 ESKAPE 병원체, 아신토박터 baumannii에초점을 맞추고 있지만,이 프로토콜은 그람 음성 유기체의 넓은 범위에 순종.
Abstract
트랜스포슨 시퀀싱(Tn-seq)은 광범위한 환경 조건하에서 세균 적합성에 기여하는 유전자와 경로를 식별하기 위해 트랜스포슨 돌연변이 발생과 대규모 병렬 시퀀싱을 결합한 강력한 방법입니다. Tn-seq 응용 프로그램은 광범위하고 유기체 수준에서 뿐만 아니라 인구, 지역 사회 및 시스템 수준에서 유전자형 표현형 관계의 검사를 가능하게했다. 그람 음성 박테리아는 항균 저항 표현형과 매우 관련이 있으며, 이는 항생제 치료 실패의 인시던트를 증가시켰습니다. 항균 저항은 그렇지 않으면 치명적인 항생제의 존재에 세균성 성장으로 정의됩니다. “마지막 줄” 항균 colistin 그람 음성 세균 감염을 치료 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 아신토박터 baumannii를 포함한 몇몇 그람 음성 병원체는 Tn-seq를 사용하여 특징지어진 분자 기계장치의 범위를 통해 colistin 저항을 개발할 수 있습니다. 또한, colistin 저항을 조절 하는 신호 변환 경로 그람 부정적인 박테리아 내에서 변화. 여기서 는 제한 효소, 어댑터 리칭 및 젤 정화의 필요성을 제거하여 포화 트랜스포온 삽입 라이브러리 및 앰플리션 라이브러리 건설의 생성을 간소화하는 A. baumannii에서 트랜스포슨 돌연변이 발생의 효율적인 방법을 제안합니다. 본 원에 기재된 방법은 colistin에 도전할 때 A. baumannii 피트니스에 기여하는 분자 결정요인의 심층분석을 가능하게 할 것이다. 프로토콜은 또한 그밖 그람 음성 ESKAPE 병원체에 적용됩니다, 주로 약 저항하는 병원 취득한 감염과연관됩니다.
Introduction
항생제의 발견은 의심 할 여지없이 20세기의 가장 영향력있는 건강 관련 사건 중 하나입니다. 항생제는 심각한 세균 감염을 신속하게 해결할 뿐만 아니라 현대 의학에서도 중추적인 역할을 합니다. 신생아 의과 및 화학요법의 주요 수술, 이식 및 어드밴스는 생명을 위협하는 감염에 취약한 환자를 남겨두고 이러한 치료법은 항생제1,,2없이는 불가능할 것이다. 그러나, 인간 병원체 중 항생제 내성의 급속한 발달 및 확산은 항생제3의모든 임상적으로 중요한 클래스의 효능을 현저히 감소시켰습니다. 한 번 쉽게 항생제 치료로 삭제 된 많은 세균 성 감염, 더 이상 글로벌 공중 보건에 심각한 위협을 일으키는 고전적인 치료 프로토콜에 응답하지않습니다 1. 항균 성 내성 (AMR)은 치료 기간4,,5에관계없이 세균 세포가 항생제의 치명적인 농도에서 성장하는 곳입니다. AMR을 조절하는 분자 및 생화학적 요인을 이해해야 하는 긴급한 필요성이 있으며, 이는 대체 항균 발달을 안내하는 데 도움이 될 것입니다. 특히, ESKAPE 병원체는 임상 환경에서 문제가 있으며 광범위한 AMR과 관련이 있습니다. 여기에는 Enterococcus faecium, Staphylococcus 아우레우스, K렙시엘라 폐렴, 시네토박터바우마니, P수도모나스 아에루기노사 및 Enterobacter spp가 포함됩니다. 몇몇 기계장치는 ESKAPE 병원체에 있는 AMR에 기여하는 동안, 후자의 4개의 유기체는 그람 음성입니다.
그람 음성 박테리아는 불리한 환경 조건으로부터 그들을 보호하는 정의 외부 막을 조립합니다. 외부 막은 항생제와 같은 독성 분자의 진입을 세포로 제한하는 투과성 장벽역할을 합니다. 다른 생물학적 멤브레인과 달리 외부 막은 비대칭입니다. 외부 전단지는 표면에 노출된 리포폴리사카라이드로 풍부하고, 내부 전단지는 인지질6의혼합물이다. 지질성 당항 분자는 지질 이중층7내에 내장된 보존된 지질 A moiety에 의해 외부 막에 고정된다. 에세리치아 대장균 리포폴리사카라이드의 정식 지질 은 대부분의 그램 음성 박테리아의 성장에 필요하며 그람 음성 유기체에서 가장 근본적이고 보존된 통로 중 하나인 9단계 효소 경로에 의해 합성된다6,,7,,8.
다묘신은 외막을 교란시키고 세포를 분해하기 위해 지질 A 도메인을 표적으로 하는 양이온 항균 펩티드입니다. 폴리마이신의 양전하 잔류물과 음전하 지질 A 인산염 군 사이의 정전기 상호 작용은 궁극적으로 세포사멸9,,10,,11,,12,,13로이어지는 세균세포막을 방해한다. Colistin (polymyxin E)는 아신토박터 baumannii14,,15,,16과같은 다약물 내성 그람 음성 외유성 병원균으로 인한 감염을 치료하는 데 사용되는 최후의 수단 항균제이다. 1947년에 처음 발견된 폴리마이신은 토양 박테리아인 파니바실러스 폴리멕사17,,18,,19에의해 생산된다. 다각형은 중요한 신증후군 및 신경독성20,,21의보고 때문에 그들의 임상 사용이 제한되기 전에 년 동안 그람 음성 감염을 취급하기 위하여 처방되었습니다.
A. baumannii는 최근 수십 년 동안 환자 결과의 이환율과 사망률을 극적으로 증가시킨 nosocomial Gram 음성 병원체입니다22. 한 때 저위협 병원체로 여겨졌던 것은, 이제 AMR을 취득하는 놀라운 능력과 전염병23,,24의고위험 때문에 전 세계적으로 병원 취득한 감염에 대한 중요한 위험을 제기합니다. A. baumannii는 미국에서 nosocomial 감염의 10% 이상을 차지합니다. 질병은 폐렴, 세균, 요로 감염, 피부 및 연조직 감염, 뇌막염 및 내막염(25)으로나타납니다. A. baumannii 감염에 대한 치료 옵션은 β- lactams, 불소 퀴놀론, 테트라사이클린 및 아미노 글리코 사이드23,,24를포함하여 거의 모든 항생제 클래스에 대한 저항으로 인해 감소되었습니다. 다약물 내성, 광범위하게 약물 내성 및 범약 내성 A. baumannii 격리의 보급은 colistin 치료에 부활을 주도하고있다, 이는 여전히 다약물 내성 A. baumannii에대한 효과적인 몇 가지 남아있는 치료 옵션 중 하나가 될 것으로 생각되었다. 그러나, A. baumannii 격리 중 증가 된 colistin 저항은 글로벌 공중 보건,10,11,,12,13,27,,,,30,,31에대한 위협을 더욱 증폭시켰다.30
트랜스포슨 시퀀싱(Tn-seq)과 같은 고처리량 시퀀싱 기술의 최근 발전은 시험관 내 및 생체 내 세균 적합성에 대한 이해를 증진시키는 중요한 도구를 제공했습니다. Tn-seq는 박테리아에서 유전자형 표현형 상호 작용을 연구하기 위해 활용할 수 있는 강력한 도구입니다. Tn-seq는 기존의 트랜스포손 돌연변이 발생과 대규모 병렬 시퀀싱을 결합하여 삽입 부위를 빠르게 매핑하는 세균 병원체 전반에 광범위하게 적용되며, 이는 DNA 돌연변이를 게놈 전체 척도32,,33,,34,35에대한 페노티픽 변이체에 연결하는 데 사용될 수 있다., 트랜스포슨 돌연변이 발생 방법은 이전에 설명되었지만 일반적인 단계는33과유사합니다. 첫째, 삽입 라이브러리는 트랜스포슨 돌연변이 발생을 사용하여 생성되며, 인구 내의 각 세균 세포는 게놈 DNA(gDNA) 내의 단일 트랜스포슨 삽입으로 제한됩니다. 돌연변이 발생 에 따라 개별 돌연변이가 풀로 들어오게됩니다. gDNA는 삽입 돌연변이 풀에서 추출되고 트랜스포슨 접합은 증폭되고 고처리량 시퀀싱을 받습니다. 판독은 게놈에 매핑될 수 있는 삽입 부위를 나타냅니다. 체력을 감소시키는 트랜스포슨 삽입은 인구에서 빠르게 떨어지고 유익한 삽입은 풍부합니다. Tn-seq는 유전자가 스트레스33에서세균 성 피트니스에 미치는 영향에 대한 이해를 증진시키는 데 중요한 역할을해 왔습니다.
pJNW684에 인코딩된 히마1 마리너 트랜스포슨 시스템은 트랜스포슨 돌연변이 발생을 목적으로 특별히 제작및 최적화되었다. 그것은 A. baumannii에서 트랜스포슨 삽입 돌연변이의 선택에 사용되는 카나마이신 저항 유전자를 측면에 선원– 가족 트랜스 포슨을 포함한다. 또한 트랜스포사제 인코딩유전자(36)의발현을 구동하는 A. baumannii 특정 프로모터를 인코딩한다. 마리너기반 트랜스포슨은 또한 삽입37의판독 다운스트림을 방지하는 카나마이신 저항 유전자의 하류에 두 개의 번역 종기를 포함한다. pJNW684는 또한38을복제하기 위해 기증자 균주에 의해 기여된 λpir 유전자를 필요로 하는 복제의 RP4/oriT/oriR6K-조건부 기원을 전달한다. λpir 유전자가 없는 경우, 전치 기계를 운반하는 pJNW684 벡터는 A. baumannii 수신자 균주10,,36,,38에서복제할 수 없다. 따라서, 세균성 컨쥬게이션 도중, 트랜스포지온만이 트랜스포지아제 유전자를 운반하는 플라스미드의 배경 삽입 없이 수신자 게놈에 삽입된다. 이것은 플라스미드와 함께 트랜스포지아제 활동의 손실이 수신자 게놈에 삽입되면 트랜스포슨이 다른 위치로 이동하는 것을 방지하는 단일, 안정적인 전치 이벤트에서 결과하기 때문에 중요합니다.
pJNW648은 또 다른 그램 음성 유기체인 대장균에서의활성을 테스트하였다. 대장균 균주 W3110에서 포화 Tn-seq 라이브러리의 성공적인 조립은 시스템이 엔테로박테리아를 포함한 광범위한 병원균에서 돌연변이 발생을 수행할 수 있음을 나타냈다. 또한 트랜스포세아제 발현을 구동하는 A. baumannii 특정 프로모터는 종별 프로모터와 신속하게 교환할 수 있습니다. 마지막으로, 카나마이신 저항 유전자는 연구 중인 유기체의 AMR 표현형에 따라 다른 저항 카세트로 교환될 수 있다.
A. baumannii에서 colistin 저항에 기여하는 한 가지 요인은 박테리아가 비 치명적인 수준에서 선택적 압력에 노출되는 불충분한 복용량의 관리입니다39. 여러 보고서는 억제 항균 농도가,전체 세균,집단11,12,30,31의감수성을 감소시키기 위해 세포 생리학을 변화시키는 조절된 반응을 유도할 수 있음을 보여주었다., Tn-seq를 사용하여, 우리는 A. baumannii 균주 ATCC 17978에 있는 colistin 저항을 조절하는 요인을 발견10 및 colistin의 억제 농도에 노출 한 후.10 이 예제에서는 선원기반 트랜스포슨제품군(40,,41)을사용하여 포화 트랜스포손 돌연변이 라이브러리의 구성 및 농축을 간소화하는 Tn-seq 방법을 자세히 설명합니다. 여러 Tn-seq 프로토콜은 20,000 – 100,000 돌연변이35,,42,,43,,44,,45,,46을생성하는 반면, 본원에 설명된 프로토콜은 400,000+ 돌연변이의 트랜스포슨 라이브러리를 신속하게 생성할 수 있으며, 이는 대략10개의베이스 10쌍의 아포 스트랜톤 삽입과 동일합니다. A. baumannii 또한, 라이브러리 크기를 크게 추가없이 확장할 수 있습니다. 이 방법은 또한 최종 라이브러리 다양성을 줄일 수있는 제한 엔토넥션, 어댑터 결찰 및 젤 정화에 대한 요구 사항을 제거합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
A. baumannii는 colistin,,,10,11,12, 23,,24,2330, 31과같은 “최후의 라인”치료에 대한 AMR의 급속한 인수로 인해 글로벌 공중 보건에 새로운 위협이되고30있습니다., 최근 수십 년 동안 Tn-seq는 수많은 세균 종에 걸쳐 유전자형 표?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 보건 원 (그랜트 AI146829에서 J.M.B.에 대한 자금 지원)에 의해 지원되었으며 감사하게 인정받고 있습니다.
Materials
| 10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate | Affymetrix | 77112 | |
| 100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate | Invitrogen | 10217-016 | |
| 100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker | Promega | PR-G2101 | |
| 100mm x 15mm Petri Dishes | Corning | 351029 | |
| 150mm x 15mm Petri Dishes | Corning | 351058 | |
| 1X B&W | N/A | N/A | Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W. |
| 2,6-Diaminopimelic acid | Alfa Aesar | B2239103 | used at 600 µM |
| 2X B&W | N/A | N/A | Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature. |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| 9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP | N/A | N/A | 9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C. |
| AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 12344 | |
| Acinetobacter baumannii ATCC 17978 | ATCC | N/A | AmpS, KanS |
| Ampicillin (100 mg/L) | Fisher Scientific | BP1760 | used at 100 mg/L |
| AMPure XP PCR purification system | BECKMAN COULTER | A63881 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939B | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis | Agilent | 5067-4626 | |
| Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP) | New England Biolabs (NEB) | N0447L | |
| DynaMag-2 Magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| E.coli MFD Dap- | N/A | N/A | DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36). |
| Ethanol | Fisher Scientific | A4094 | |
| Externally Threaded Cryogenic Vials | Corning | 09-761-71 | |
| Glass beads | Corning | 72684 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33 | |
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-602 | Scraping tool |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | used at 25 mg/L |
| LB agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426 | |
| LoTE | N/A | N/A | Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature. |
| Lysis buffer | N/A | N/A | 9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL) |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.) | Fisher Scientific | BP1752I | |
| Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher Scientific | BP39920 | Diluted to 1X |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33238 | |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| Sonicator with refridgerated waterbath | Qsonica Sonicators | Q2000FCE | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs (NEB) | S1420S | |
| TE buffer | N/A | N/A | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0) |
| Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt) | Promega | PR-M1875 |
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