Generieren von Transposon-Einfügungsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz

Summary

Wir beschreiben eine Methode zur Generierung von sättigungsverstärkenden Mutationsbibliotheken in gramnegativen Bakterien und der anschließenden Herstellung von DNA-Amplikonbibliotheken für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Als Beispiel konzentrieren wir uns auf den ESKAPE-Erreger Acinetobacter baumannii, aber dieses Protokoll ist für eine Vielzahl von Gram-negativen Organismen zugänglich.

Abstract

Transposon-Sequenzierung (Tn-seq) ist eine leistungsstarke Methode, die Transposon-Mutagenese und massive parallele Sequenzierung kombiniert, um Gene und Wege zu identifizieren, die zur bakteriellen Fitness unter einer Vielzahl von Umweltbedingungen beitragen. Tn-seq-Anwendungen sind umfangreich und haben nicht nur die Untersuchung von Genotyp-Phänotyp-Beziehungen auf Organismusebene ermöglicht, sondern auch auf Populations-, Gemeinschafts- und Systemebene. Gram-negative Bakterien sind stark mit antimikrobiellen Resistenz Phänotypen verbunden, die erhöhte Vorfälle von Antibiotika-Behandlungsversagen hat. Antimikrobielle Resistenz ist definiert als bakterielles Wachstum in Gegenwart von ansonsten tödlichen Antibiotika. Das antimikrobielle Colistin der “letzten Linie” wird zur Behandlung von gramnegativen bakteriellen Infektionen eingesetzt. Jedoch, mehrere Gram-negative Krankheitserreger, einschließlich Acinetobacter baumannii kann Colistin-Resistenz durch eine Reihe von molekularen Mechanismen entwickeln, von denen einige mit Tn-seq charakterisiert wurden. Darüber hinaus variieren Signaltransduktionswege, die die Colistinresistenz regulieren, innerhalb gramnegativer Bakterien. Hier schlagen wir eine effiziente Methode der Transposon-Mutagenese in A. baumannii vor, die die Erzeugung einer sättigenden Transposon-Einfügungsbibliothek und amplicon-Bibliothekskonstruktion rationalisiert, indem die Notwendigkeit von Restriktionsenzymen, Adapterligation und Gelreinigung entfällt. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen eine eingehende Analyse molekularer Determinanten, die zur A. baumannii-Fitness beitragen, wenn sie mit Colistin herausgefordert werden. Das Protokoll gilt auch für andere Gram-negative ESKAPE-Erreger, die in erster Linie mit medikamentenresistenten Krankenhausinfektionen in Verbindung gebrachtwerden.

Introduction

Die Entdeckung von Antibiotika ist zweifellos eines der folgenreichsten gesundheitsbezogenen Ereignisse des^20. Jahrhunderts. Antibiotika lösen nicht nur schwere bakterielle Infektionen schnell auf, sie spielen auch eine zentrale Rolle in der modernen Medizin. Größere Operationen, Transplantationen und Fortschritte in der Neonatalmedizin und Chemotherapie lassen Patienten anfällig für lebensbedrohliche Infektionen und diese Therapien wären ohne Antibiotika nicht möglich^1,2. Jedoch, schnelle Entwicklung und Ausbreitung der Antibiotikaresistenz unter menschlichen Krankheitserregern hat die Wirksamkeit aller klinisch wichtigen Klassen von Antibiotika deutlich verringert³. Viele bakterielle Infektionen, die einst leicht mit Antibiotika-Behandlung entimiert wurden, reagieren nicht mehr auf klassische Behandlungsprotokolle, was eine ernsthafte Bedrohung für die globale öffentliche^Gesundheit1 . Antimikrobielle Resistenz (AMR) ist, wo Bakterienzellen in ansonsten tödlichen Konzentrationen von Antibiotika wachsen, unabhängig von der Behandlungsdauer^4,5. Es ist dringend notwendig, molekulare und biochemische Faktoren zu verstehen, die AMR regulieren, was dazu beitragen wird, die alternative antimikrobielle Entwicklung zu steuern. Insbesondere ESKAPE-Erreger sind im klinischen Umfeld problematisch und mit umfangreicher AMR verbunden. Dazu gehören Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa und Enterobacter spp. Während mehrere Mechanismen bei ESKAPE-Erregern zur AMR beitragen, sind die letzten vier Organismen gramnegativ.

Gram-negative Bakterien montieren eine definierende äußere Membran, die sie vor widrigen Umweltbedingungen schützt. Die äußere Membran dient als Durchlässigkeitsbarriere, um den Eintritt toxischer Moleküle wie Antibiotika in die Zelle zu beschränken. Im Gegensatz zu anderen biologischen Membranen ist die äußere Membran asymmetrisch. Die äußere Packungsbeilage ist mit oberflächenexponiertem Lipopolysaccharid angereichert, während die innere Packungsbeilage eine Mischung aus Phospholipiden⁶ist. Lipopolysaccharidmoleküle werden durch ein konserviertes Lipid A-Moiety, das in die Lipid-Bilayer⁷eingebettet ist, an der äußeren Membran verankert. Das kanonische Lipid Eine Domäne von Escherichia coli Lipopolysaccharid wird für das Wachstum der meisten Gram-negativen Bakterien benötigt und wird durch einen neunstufigen enzymatischen Weg synthetisiert, der einer der grundlegendsten und konserviertesten Wege in Gram-negativen Organismen^6,7,8ist.

Polymyxine sind kationische antimikrobielle Peptide, die auf die Lipid-A-Domäne von Lipopolysaccharid abzielen, um die äußere Membran zu stören und die Zelle zu lysen. Die elektrostatische Wechselwirkung zwischen positiv geladenen Rückständen von Polymyxinen und den negativ geladenen Lipid-A-Phosphatgruppen stören die bakterielle Zellmembran, was letztlich zum Zelltod^{9,,10,11,12,13}führt. Colistin (Polymyxin E) ist ein letztes Mittel antimikrobielle zur Behandlung von Infektionen durch multiresistente Gram-negative nosokomiale Krankheitserreger, wie Acinetobacter baumannii^14,15,16. Erstmals 1947 entdeckt, werden Polymyxine von den Bodenbakterien Paenibacillus polymyxa^17,18,19produziert. Polymyxine wurden zur Behandlung von Gram-negativen Infektionen jahrelang verschrieben, bevor ihre klinische Anwendung aufgrund von Berichten über signifikante Nephro- und Neurotoxizität^20,21begrenzt war.

A. baumannii ist ein nosokomialer Gram-negativer Erreger, der die Morbidität und Sterblichkeit der Patientenergebnisse in den letzten Jahrzehnten dramatisch erhöht hat²². Was einst als ein schwacher Erreger galt, stellt heute ein erhebliches Risiko für krankenhauserworbene Infektionen auf der ganzen Welt aufgrund seiner unglaublichen Fähigkeit, AMR zu erwerben und hohes Risiko der Epidemie^23,24. A. baumannii ist für mehr als 10% der nosokomialen Infektionen in den Vereinigten Staaten. Krankheit manifestiert sich als Lungenentzündung, Bakteriämie, Harnwegsinfektionen, Haut- und Weichteilinfektionen, Meningitis und Endokarditis²⁵. Behandlungsmöglichkeiten für A. baumannii Infektionen sind aufgrund der Resistenz gegen fast alle Antibiotika-Klassen, einschließlich β-Lactams, Fluorchinolone, Tetracyclin, und Aminoglykoside^23,24. Die Prävalenz multiresistenter, extensiv medikamentenresistenter und pan-drogenresistenter A. baumannii-Isolate hat zu einem Wiederaufleben der Colistin-Behandlung geführt, die als eine der wenigen verbleibenden therapeutischen Optionen angesehen wurde, die noch wirksam gegen multiresistente A. baumanniisind. Jedoch, erhöhte Colistin Resistenz unter A. baumannii Isolate hat seine Bedrohung für die globale öffentliche Gesundheit weiter verstärkt^{10,11,12,13,27,30,31}.

Die jüngsten Fortschritte bei den Sequenzierungstechnologien mit hohem Durchsatz, wie z. B. die Transposonsequenzierung (Tn-seq), haben wichtige Werkzeuge geliefert, um unser Verständnis der bakteriellen Fitness in vitro und in vivozu verbessern. Tn-seq ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das genutzt werden kann, um Gennotyp-Phänotyp-Wechselwirkungen bei Bakterien zu untersuchen. Tn-seq ist allgemein anwendbar auf bakterielle Krankheitserreger, wo es traditionelle Transposon-Mutagenese mit massiver paralleler Sequenzierung zu schnellen Karteneinfügungsstellen kombiniert, die verwendet werden können, um DNA-Mutationen mit phänotypischen Varianten im genomweiten Maßstab^32,33,34,35zu verknüpfen. Während Transposon-Mutagenese-Methoden bereits beschrieben wurden, sind die allgemeinen Schritte ähnlich³³. Zunächst wird eine Insertionsbibliothek mittels Transposon-Mutagenese erzeugt, wobei jede Bakterienzelle innerhalb einer Population auf eine einzelne Transposon-Insertion in die genomische DNA (gDNA) beschränkt ist. Nach der Mutagenese werden einzelne Mutanten gepoolt. gDNA wird aus dem Insertionsmutantpool extrahiert und die Transposonknoten verstärkt und einer Hochdurchsatzsequenzierung unterzogen. Die Lesevorgänge stellen Einfügestellen dar, die dem Genom zugeordnet werden können. Transposon-Einfügungen, die die Fitness reduzieren, fallen schnell aus der Bevölkerung, während nützliche Einfügungen bereichert werden. Tn-seq war maßgeblich daran beteiligt, unser Verständnis dafür zu fördern, wie Gene die bakterielle Fitness in Stress beeinflussen³³.

Das in pJNW684 kodierte Himar1-Marinetransposonsystem wurde speziell für die Transposon-Mutagenese konstruiert und optimiert. Es enthält ein Mariner-Familientransposon, das das Kanamycin-Resistenzgen flankiert, das für die Auswahl von Transposoninsertionsmutanten in A. baumannii verwendet wird. mariner Es kodiert auch einen A. baumannii spezifischen Promotor, der die Expression des Transposase-Codierungsgens³⁶antreibt. Das marinebasierteTransposon enthält auch zwei translationale Terminatoren nach dem Kanamycin-Resistenzgen, die ein Durchlesen flussabwärts der Insertion³⁷verhindern. pJNW684 enthält auch einen RP4/oriT/oriR6K-bedingten Replikationsursprung, der das vom Spenderstamm beigesteuerte ‘pir-Gen erfordert, um³⁸zu replizieren. In Ermangelung des Gens von ‘pir’ kann sich der pJNW684-Vektor, der die Transpositionsmaschinerie trägt, nicht im A. baumannii-Empfängerstamm ^10,36,38replizieren. Daher wird während der bakteriellen Konjugation nur das Transposon in das Empfängergenom ohne Hintergrundeinfügung des Plasmids eingeführt, das das Transposase-Gen trägt. Dies ist wichtig, da der Verlust der Transposaseaktivität zusammen mit dem Plasmid zu einem einzigen, stabilen Transpositionsereignis führt, das verhindert, dass sich das Transposon an verschiedene Stellen bewegt, sobald es in das Empfängergenom einfügt.

pJNW648 wurde auch auf Aktivität in einem anderen gramnegativen Organismus, E. coli,getestet. Die erfolgreiche Montage einer sättigenden Tn-seq-Bibliothek im E. coli-Stamm W3110 zeigte, dass das System für die Durchführung von Mutagenese bei einer Vielzahl von Krankheitserregern, einschließlich Enterobacteriaceae, geeignet ist. Darüber hinaus kann der a. baumannii-spezifische Promotor, der den Transposase-Ausdruck antreibt, schnell mit einem artspezifischen Promotor ausgetauscht werden. Schließlich kann das Kanamycin-Resistenzgen in andere Resistenzkassetten ausgetauscht werden, abhängig vom AMR-Phänotyp des untersuchten Organismus.

Ein Faktor, der zur Colistinresistenz bei A. baumannii beiträgt, ist die Verabreichung unzureichender Dosen, bei denen Bakterien selektivem Druck auf nicht-tödlichen Ebenen ausgesetzt sind³⁹. Mehrere Berichte zeigten, dass subhemmende antimikrobielle Konzentrationen regulierte Reaktionen induzieren können, die die Zellphysiologie verändern, um die Anfälligkeit der gesamten Bakterienpopulation zu reduzieren^11,12,30,31. Mit Tn-seq entdeckten wir Faktoren, die die Colistinresistenz im A. baumannii-Stamm ATCC 17978 nach Exposition gegenüber hemmenden¹⁰ und subhemmenden Konzentrationen von Colistin regulieren. In diesem Beispiel wird eine Tn-seq-Methode erläutert, die den Aufbau und die Anreicherung einer gesättigten Transposon-Mutantenbibliothek mithilfe der auf Seetierenbasierenden Transposons-Familie^40,41optimiert. Während mehrere Tn-seq-Protokolle 20.000 – 100.000 Mutanten^{35,42,43,44,45,46}erzeugen, kann das hier beschriebene Protokoll schnell eine Transposonbibliothek von 400.000 + Mutanten erzeugen, was in etwa einer Transposoneinfügung in A. baumannii¹⁰entspricht. Darüber hinaus kann die Bibliotheksgröße ohne erheblichen zusätzlichen Aufwand vergrößert werden. Diese Methode eliminiert auch die Anforderung für Restriktionsendonukleasen, Adapterligation und Gelreinigung, die die endgültige Bibliotheksvielfalt reduzieren können.

Protocol

1. Bakterielle Stammvorbereitung Streichen Sie den “Spender”-Stamm (E. coli MFD DAP-/pJNW684, Materialtabelle) für isolierte Kolonien auf Luria-Bertani-Agar, ergänzt mit 600 M Diaminopimelsäure (DAP), 100 mg/L Ampicillin und 25 mg/L Kanamycin. Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Mit einer einzigen isolierten Kolonie, impfen 50 ml Luria Brühe (LB) ergänzt mit 600 ‘M DAP, 100 mg/L Ampicillin und 25 mg/L Kanamycin in einem 250 ml Erlenmeyer Kolben und kennzeichnen Sie es a…

Representative Results

Die skizzierten Methoden beschreiben die Erzeugung einer Transposonbibliothek mit hoher Dichte im A. baumannii-Stamm ATCC 17978 durch bakterielle Konjugation mit E. coli MFD DAP- ,die das Plasmid pJNW684 repliziert (Abbildung 4B). Das detaillierte Protokoll verwendet die bielte bakterielle Konjugation für die Übertragung von pJNW684 vom E. coli-Pir+ Spenderstamm auf den A. baumannii-Empfängerstamm. Dies ist eine effiziente und kost…

Discussion

A. baumannii ist eine neue Bedrohung für die globale öffentliche Gesundheit aufgrund der schnellen Übernahme von AMR gegen “Last-Line”-Therapeutika, wie Colistin^{10,11,12,23,24,30,31}. In den letzten Jahrzehnten hat Tn-seq eine entscheidende Rolle bei der Aufklärung von Genotyp-Ph…

Materials

10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate	Affymetrix	77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate	Invitrogen	10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker	Promega	PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351029
150mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351058
1X B&W	N/A	N/A	Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid	Alfa Aesar	B2239103	used at 600 µM
2X B&W	N/A	N/A	Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP	N/A	N/A	9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)	Fisher Scientific	BP1760	used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system	BECKMAN COULTER	A63881
BioAnalyzer	Agilent	G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis	Agilent	5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP)	New England Biolabs (NEB)	N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack	Invitrogen	12321D
E.coli MFD Dap-	N/A	N/A	DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol	Fisher Scientific	A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials	Corning	09-761-71
Glass beads	Corning	72684
Glycerol	Fisher Scientific	G33
Inoculating loops	Fisher Scientific	22-363-602	Scraping tool
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906	used at 25 mg/L
LB agar, Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426
LoTE	N/A	N/A	Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer	N/A	N/A	9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.)	Fisher Scientific	BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher Scientific	BP39920	Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33238
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher	Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath	Qsonica Sonicators	Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs (NEB)	S1420S
TE buffer	N/A	N/A	10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)	Promega	PR-M1875