Generación de bibliotecas de inserción Transposon en bacterias Gram-negativas para secuenciación de alto rendimiento

Summary

Describimos un método para generar saturación de bibliotecas mutantes transposon en bacterias Gram-negativas y la posterior preparación de bibliotecas de amplicón de ADN para la secuenciación de alto rendimiento. Como ejemplo, nos centramos en el patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, pero este protocolo es susceptible a una amplia gama de organismos Gram-negativos.

Abstract

La secuenciación de Transposon (Tn-seq) es un método potente que combina la mutagénesis transposon y la secuenciación paralela masiva para identificar genes y vías que contribuyen a la aptitud bacteriana bajo una amplia gama de condiciones ambientales. Las aplicaciones de Tn-seq son extensas y no sólo han permitido examinar las relaciones genotipo-fenotipo a nivel de organismo, sino también a nivel de población, comunidad y sistemas. Las bacterias gramnegativas están altamente asociadas con fenotipos de resistencia a los antimicrobianos, lo que ha aumentado los incidentes de fracaso del tratamiento con antibióticos. La resistencia a los antimicrobianos se define como crecimiento bacteriano en presencia de antibióticos letales. La colistina antimicrobiana de “última línea” se utiliza para tratar las infecciones bacterianas Gram-negativas. Sin embargo, varios patógenos Gram-negativos, incluyendo Acinetobacter baumannii pueden desarrollar resistencia a la colistina a través de una gama de mecanismos moleculares, algunos de los cuales se caracterizaron usando Tn-seq. Además, las vías de transducción de señales que regulan la resistencia a la colistina varían dentro de las bacterias Gram-negativas. Aquí proponemos un método eficiente de mutagénesis transposon en A. baumannii que agiliza la generación de una biblioteca de inserción de transposon saturante y la construcción de la biblioteca de amplicon eliminando la necesidad de enzimas de restricción, ligadura de adaptador y purificación de gel. Los métodos descritos en este documento permitirán un análisis en profundidad de los determinantes moleculares que contribuyen a la aptitud de A. baumannii cuando se enfrentan al desafío con colistina. El protocolo también es aplicable a otros patógenos GRAM-negativos ESKAPE, que se asocian principalmente con infecciones adquiridas en hospitales resistentes a losmedicamentos.

Introduction

El descubrimiento de antibióticos es sin duda uno de los eventos más impactantes relacionados con la salud^del siglo XX. Los antibióticos no solo resuelven rápidamente las infecciones bacterianas graves, sino que también desempeñan un papel fundamental en la medicina moderna. Las cirugías mayores, los trasplantes y los avances en la medicina neonatal y la quimioterapia dejan a los pacientes susceptibles a infecciones potencialmente mortales y estas terapias no serían posibles sin antibióticos^1,2. Sin embargo, el rápido desarrollo y la propagación de la resistencia a los antibióticos entre los patógenos humanos ha disminuido significativamente la eficacia de todas las clases clínicamente importantes de antibióticos^3. Muchas infecciones bacterianas que una vez fueron fácilmente despejadas con tratamiento con antibióticos, ya no responden a los protocolos de tratamiento clásicos, causando una grave amenaza a la salud pública mundial¹. La resistencia a los antimicrobianos (AMR) es donde las células bacterianas crecen en concentraciones letales de antibióticos, independientemente de la duración del tratamiento^4,5. Es urgente comprender los factores moleculares y bioquímicos que regulan la resistencia a los antimicrobianos, lo que ayudará a guiar el desarrollo antimicrobiano alternativo. Específicamente, los patógenos de ESKAPE son problemáticos en entornos clínicos y asociados con una amplia ERM. Estos incluyen Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter spp. Mientras que varios mecanismos contribuyen a la AMR en patógenos ESKAPE, estos últimos cuatro organismos son Gram-negativos.

Las bacterias Gram-negativas ensamblan una membrana externa definitoria que las protege de condiciones ambientales adversas. La membrana externa sirve como una barrera de permeabilidad para restringir la entrada de moléculas tóxicas, como antibióticos, en la célula. A diferencia de otras membranas biológicas, la membrana externa es asimétrica. El prospecto exterior está enriquecido con lipopolisacárido expuesto a la superficie, mientras que el prospecto interno es una mezcla de fosfolípidos⁶. Las moléculas de lipopolisacárido están ancladas a la membrana externa por una mitad de lípido conservada Una incrustada dentro de la bica procapa lipídica⁷. El lípido canónico Un dominio de Escherichia coli lipopolisacárido es necesario para el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-negativas y es sintetizado por una vía enzimática de nueve pasos que es una de las vías más fundamentales y conservadas en organismos Gram-negativos^6,,7,,8.

Las polimixinas son péptidos antimicrobianos catiónicos que se dirigen al lípido Un dominio de lipopolisacárido para perturbar la membrana externa y izar la célula. La interacción electrostática entre los residuos cargados positivamente de polimixinas y los grupos de fosfato A de lípidos cargados negativamente interrumpen la membrana celular bacteriana, lo que en última instancia conduce a la muerte celular^{9,10,11,12,13}. La colistina (polimixina E) es un antimicrobiano de último recurso utilizado para tratar infecciones causadas por patógenos nosocomiales Gram-negativos multirresistentes, como Acinetobacter baumannii^14,15,16. Descubiertas por primera vez en 1947, las polimixinas son producidas por las bacterias del suelo, Paenibacillus polymyxa^17,18,19. Las polimixinas se recetaron para tratar las infecciones Gram-negativas durante años antes de que su uso clínico fuera limitado debido a los informes de nefro- y neurotoxicidad significativa^20,21.

A. baumannii es un patógeno Gram-negativo nosocomial que ha aumentado drásticamente la morbilidad y mortalidad de los resultados de los pacientes en las últimas décadas²². Lo que antes se consideraba un patógeno de baja amenaza, ahora supone un riesgo significativo para la infección adquirida en el hospital en todo el mundo debido a su increíble capacidad para adquirir AMR y alto riesgo de epidemia^23,,24. A. baumannii representa más del 10% de las infecciones nosocomiales en los Estados Unidos. La enfermedad se manifiesta como neumonía, bacteriemia, infecciones del tracto urinario, infecciones de la piel y de los tejidos blandos, meningitis y endocarditis²⁵. Las opciones de tratamiento para las infecciones por A. baumannii han disminuido debido a la resistencia contra casi todas las clases de antibióticos, incluyendo lactamos β, fluoroquinolonas, tetraciclina y aminoglucósidos^23,,24. La prevalencia de aislados multirresistentes, ampliamente resistentes a los medicamentos y pan-drogas resistentes a A. baumannii ha dado lugar a un resurgimiento del tratamiento con colistina, que se pensaba que era una de las pocas opciones terapéuticas restantes que todavía eran eficaces contra A. baumanniimultirresistente. Sin embargo, el aumento de la resistencia a la colistina entre los aislados de A. baumannii ha amplificado aún más su amenaza para la salud pública mundial^{10,11,12,13,27,30,31}.

Los recientes avances en las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, como la secuenciación de transposon (Tn-seq), han proporcionado herramientas importantes para avanzar en nuestra comprensión de la aptitud bacteriana in vitro e in vivo. Tn-seq es una poderosa herramienta que se puede aprovechar para estudiar las interacciones genotipo-fenotipo en bacterias. Tn-seq es ampliamente aplicable entre patógenos bacterianos, donde combina la mutagénesis de transposon tradicional con la secuenciación paralela masiva para mapear rápidamente sitios de inserción, que se pueden utilizar para vincular mutaciones de ADN a variantes fenotípicas en una escala genómica^{32,,33,,34,,35}. Si bien los métodos de mutagénesis de transposon se han descrito previamente, los pasos generales son similares³³. En primer lugar, se genera una biblioteca de inserción utilizando la mutagénesis transposon, donde cada célula bacteriana dentro de una población está restringida a una sola inserción de transposon dentro del ADN genómico (GDNA). Después de la mutagénesis, los mutantes individuales se agrupan. GDNA se extrae de la piscina mutante de inserción y las uniones transposon se amplifican y se someten a secuenciación de alto rendimiento. Las lecturas representan sitios de inserción, que se pueden asignar al genoma. Las inserciones de Transposon que reducen la condición física se caen rápidamente de la población, mientras que las inserciones beneficiosas se enriquecen. Tn-seq ha sido fundamental para avanzar en nuestra comprensión de cómo los genes afectan la aptitud bacteriana en el estrés^33.

El sistema de transposión de marinero Himar1 codificado en pJNW684 fue construido y optimizado específicamente para el propósito de mutagénesis transposon. Incluye un marinertransposón marinero -familia que flanquea el gen de resistencia a la kanamicina, que se utiliza para la selección de mutantes de inserción transposon en A. baumannii. También codifica un promotor específico de A. baumannii que impulsa la expresión del gen codificante transposasa³⁶. El transposon basado en marinerostambién contiene dos terminadores traslacionales aguas abajo del gen de resistencia a la kanamicina, que impide la lectura aguas abajo de la inserción^37. pJNW684 también lleva un origen de replicación condicional RP4/oriT/oriR6K que requiere que el gen -pir aportado por la cepa del donante se replique³⁸. En ausencia del gen de lospir, el vector pJNW684 que transporta la maquinaria de transposición no podrá replicarse en la cepa receptora A. baumannii ^10,36,38. Por lo tanto, durante la conjugación bacteriana, sólo se inserta el transposón en el genoma receptor sin la inserción de fondo del plásmido, que transporta el gen de la transposasa. Esto es significativo porque la pérdida de actividad transposasa junto con el plásmido da como resultado un evento de transposición único y estable que impide que el transposón se mueva a diferentes lugares una vez que se inserta en el genoma receptor.

pJNW648 también ha sido probado para la actividad en otro organismo Gram-negativo, E. coli. El éxito en el montaje de una saturación de la biblioteca Tn-seq en la cepa de E. coli W3110 indicó que el sistema es susceptible de realizar mutagénesis en una amplia gama de patógenos, incluyendo Enterobacteriaceae. Además, el promotor específico de A. baumannii que impulsa la expresión transposasa puede intercambiarse rápidamente con un promotor específico de la especie. Por último, el gen de resistencia a la kanamicina se puede cambiar por otros casetes de resistencia, dependiendo del fenotipo AMR del organismo que se está estudiando.

Un factor que contribuye a la resistencia a la colistina en A. baumannii es la administración de dosis insuficientes, donde las bacterias están expuestas a la presión selectiva a niveles no letales³⁹. Varios informes mostraron que las concentraciones antimicrobianas subinhibitorias pueden inducir respuestas reguladas que alteran la fisiología celular para reducir la susceptibilidad de toda la población bacteriana^11,12,30,31. Usando Tn-seq, descubrimos factores que regulan la resistencia a la colistina en la cepa de A. baumannii ATCC 17978 después de la exposición a concentraciones inhibitorios¹⁰ y subinhibitorias de colistina. Este ejemplo detalla un método Tn-seq que agiliza la construcción y el enriquecimiento de una biblioteca mutante transposon saturada utilizando la familia basada en marinerosde transposones^40,,41. Mientras que varios protocolos Tn-seq generan 20.000 – 100.000 mutantes^{35,42,43,44,45,46}, el protocolo descrito en este documento puede generar rápidamente una biblioteca de transposonía de 400.000 + mutantes, que equivale aproximadamente a una inserción de transposon cada 10 pares de bases en A. baumannii¹⁰. Además, el tamaño de la biblioteca se puede escalar verticalmente sin un esfuerzo adicional significativo. Este método también elimina el requisito de endonucleos de restricción, ligaduras de adaptador y purificación de gel, lo que puede reducir la diversidad final de la biblioteca.

Protocol

1. Preparación de tensión bacteriana Rayar la cepa “donante” (E. coli MFD DAP-/pJNW684, Tabla de materiales) para colonias aisladas en agar Luria-Bertani complementado con 600 M de ácido diaminopélico (DAP), 100 mg/L de ampicilina y 25 mg/L de kanamicina. Incubar durante la noche a 37oC. Utilizando una sola colonia aislada, inocular 50 ml de caldo de Luria (LB) complementado con DAP de 600 m, 100 mg/L de ampicilina y 25 mg/L de kanamicina en un matraz Erlenmeyer de 250 …

Representative Results

Los métodos descritos describen la generación de una biblioteca transposon de alta densidad en la cepa A. baumannii ATCC 17978 a través de la conjugación bacteriana utilizando E. coli MFD DAP-, que replica el plásmido pJNW684 (Figura 4B). El protocolo detallado utiliza la conjugación bacteriana bi-parental para la transferencia de pJNW684 de la cepa de donante E. coli ápir+ a la cepa receptora de A. baumannii. Este es un métod…

Discussion

A. baumannii es una amenaza emergente para la salud pública mundial debido a la rápida adquisición de AMR contra las terapias de “última línea”, como la colistina^{10,,11,12,23,24,30,31}. En las últimas décadas, Tn-seq ha desempeñado un papel fundamental en el esclarecer las in…

Materials

10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate	Affymetrix	77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate	Invitrogen	10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker	Promega	PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351029
150mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351058
1X B&W	N/A	N/A	Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid	Alfa Aesar	B2239103	used at 600 µM
2X B&W	N/A	N/A	Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP	N/A	N/A	9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)	Fisher Scientific	BP1760	used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system	BECKMAN COULTER	A63881
BioAnalyzer	Agilent	G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis	Agilent	5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP)	New England Biolabs (NEB)	N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack	Invitrogen	12321D
E.coli MFD Dap-	N/A	N/A	DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol	Fisher Scientific	A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials	Corning	09-761-71
Glass beads	Corning	72684
Glycerol	Fisher Scientific	G33
Inoculating loops	Fisher Scientific	22-363-602	Scraping tool
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906	used at 25 mg/L
LB agar, Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426
LoTE	N/A	N/A	Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer	N/A	N/A	9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.)	Fisher Scientific	BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher Scientific	BP39920	Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33238
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher	Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath	Qsonica Sonicators	Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs (NEB)	S1420S
TE buffer	N/A	N/A	10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)	Promega	PR-M1875