उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया में ट्रांसपोसन प्रविष्टि पुस्तकालयों का सृजन
Summary
हम ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया में संतृप्त ट्रांसपोसन उत्परिवर्ती पुस्तकालयों और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए डीएनए एम्प्लिकॉन पुस्तकालयों की बाद की तैयारी उत्पन्न करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। एक उदाहरण के रूप में, हम एस्केपी रोगजनक, Acinetobacter baumanniiपर ध्यान केंद्रित है, लेकिन यह प्रोटोकॉल ग्राम-नकारात्मक जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उत्तरदायी है।
Abstract
ट्रांसपोसन अनुक्रमण (टीएन-एसईक्यू) एक शक्तिशाली तरीका है जो ट्रांसपोसन म्यूटाजेनेसिस और बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण को जोड़ती है ताकि जीन और रास्तों की पहचान की जा सके जो पर्यावरणीय स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला के तहत बैक्टीरियल फिटनेस में योगदान देते हैं। टीएन-एसईक्यू अनुप्रयोग व्यापक हैं और न केवल जीव स्तर पर जीनोटाइप-फेनोटाइप संबंधों की जांच सक्षम है बल्कि जनसंख्या, समुदाय और प्रणालियों के स्तर पर भी। ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया एंटीमाइक्रोबियल रेजिस्टेंस फेनोटाइप से अत्यधिक जुड़े होते हैं, जिससे एंटीबायोटिक उपचार विफलता की घटनाएं बढ़ी हैं। रोगाणुरोधी प्रतिरोध को अन्यथा घातक एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति में बैक्टीरियल विकास के रूप में परिभाषित किया गया है। “लास्ट-लाइन” एंटीमाइक्रोबियल कोलिस्टिन का उपयोग ग्राम-नकारात्मक जीवाणु संक्रमणों के इलाज के लिए किया जाता है। हालांकि, Acinetobacter baumannii सहित कई ग्राम नकारात्मक रोगजनकों आणविक तंत्र की एक श्रृंखला के माध्यम से कोलिस्टिन प्रतिरोध विकसित कर सकते हैं, जिनमें से कुछ Tn-seq का उपयोग कर विशेषता थे । इसके अलावा, कोलिस्टिन प्रतिरोध को विनियमित करने वाले सिग्नल ट्रांसडक्शन रास्ते ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के भीतर भिन्न होते हैं। यहां हम ए बाउमैनी में ट्रांसपोसन म्यूटेगेनिसिस की एक कुशल विधि का प्रस्ताव करते हैं जो प्रतिबंध एंजाइमों, एडाप्टर लिगेशन और जेल शुद्धिकरण की आवश्यकता को नष्ट करके एक संतृप्त ट्रांसपोसन प्रविष्टि पुस्तकालय और एम्प्लिकॉन पुस्तकालय निर्माण की पीढ़ी को सुव्यवस्थित करता है। यहां वर्णित तरीकों से आणविक निर्धारकों का गहराई से विश्लेषण किया जा सकेगा जो कोलिस्टिन के साथ चुनौती दिए जाने पर ए बॉमनी फिटनेस में योगदान देते हैं। प्रोटोकॉल अन्य ग्राम-नकारात्मक एस्कापे रोगजनकों पर भी लागू होता है, जो मुख्य रूप से दवा प्रतिरोधी अस्पताल-अधिग्रहीत संक्रमणों से जुड़े होतेहैं।
Introduction
एंटीबायोटिक दवाओं की खोज निस्संदेह 20वीं सदी की सबसे प्रभावशाली स्वास्थ्य से संबंधित घटनाओं में से एक है । न केवल एंटीबायोटिक्स गंभीर बैक्टीरियल संक्रमण को जल्दी से हल करते हैं, वे आधुनिक चिकित्सा में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। नवजात चिकित्सा और कीमोथेरेपी में प्रमुख सर्जरी, प्रत्यारोपण और प्रगति रोगियों को जीवन के लिए खतरा संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील छोड़ देते हैं और ये उपचार एंटीबायोटिक दवाओं के बिना संभव नहीं होंगे1,,2। हालांकि, मानव रोगजनकों के बीच एंटीबायोटिक प्रतिरोध के तेजी से विकास और प्रसार ने एंटीबायोटिक दवाओं के सभी चिकित्सकीय रूप से महत्वपूर्ण वर्गों की प्रभावकारिता में काफी कमी आई है3। कई जीवाणु संक्रमण है कि एक बार आसानी से एंटीबायोटिक दवाओं के उपचार के साथ मंजूरी दे दी थी, अब क्लासिक उपचार प्रोटोकॉल का जवाब है, वैश्विक सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरापैदा 1। एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध (एएमआर) वह जगह है जहां जीवाणु कोशिकाएं एंटीबायोटिक दवाओं की अन्यथा घातक सांद्रता में बढ़ती हैं, चाहे उपचार अवधि4,,5 कीपरवाहकिए बिना। एएमआर को विनियमित करने वाले आणविक और जैव रासायनिक कारकों को समझने की तत्काल आवश्यकता है, जिससे वैकल्पिक रोगाणुरोधी विकास का मार्गदर्शन करने में मदद मिलेगी । विशेष रूप से, एस्कापे रोगजनक नैदानिक सेटिंग्स में समस्याग्रस्त हैं और व्यापक एएमआर से जुड़े हैं। इनमें ईनेटरोकोकस फेक्यूम, एसटैफिलोकोकस ऑरियस, केलेबसीला निमोनिया, एकसिनेटोबैक्टर बाउमैनी, पीसेडोमोनास एरुगिनोसा और ईएनटीरोबैक्टर एसपीपी शामिल हैं। जबकि कई तंत्र एस्केपे रोगजनकों में एएमआर में योगदान देते हैं, बाद के चार जीव ग्राम-नकारात्मक हैं।
ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया एक परिभाषित बाहरी झिल्ली को इकट्ठा करते हैं जो उन्हें प्रतिकूल पर्यावरणीय स्थितियों से बचाता है। बाहरी झिल्ली कोशिका में एंटीबायोटिक दवाओं जैसे जहरीले अणुओं के प्रवेश को प्रतिबंधित करने के लिए एक पारमिबिलिटी बाधा के रूप में कार्य करती है। अन्य जैविक झिल्ली के विपरीत, बाहरी झिल्ली विषम है। बाहरी पत्रक सतह से उजागर लिपोपोलिनासैकराइड से समृद्ध है, जबकि आंतरिक पत्रक फॉस्फोलिपिड6का मिश्रण है। लिपोपोलिनासैकराइड अणुओं को बाहरी झिल्ली में एक संरक्षित लिपिड द्वारा लंगर डाला जाता है जो लिपिड बाइलेयर7के भीतर एम्बेडेड एक मोइटी है । विहित लिपिड सबसे अधिक ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के विकास के लिए एस्चेरिचिया कोलाई लिपोपॉलीसकैचराइड का एक डोमेन आवश्यक है और इसे नौ-चरणों वाले एंजाइमेटिक मार्ग द्वारा संश्लेषित किया जाता,है जो ग्राम-नकारात्मक जीवों6,,7,8में सबसे मौलिक और संरक्षित मार्गों में से एक है।
पॉलीमाइक्सिन्स एंटिक एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड्स होते हैं जो लिपिड को बाहरी झिल्ली को परेशान करने और कोशिका को लाइसे करने के लिए लिपोपोलिनासैकराइड के डोमेन को लक्षित करते हैं। पॉलीमाइक्सिन के सकारात्मक आवेशित अवशेषों और नकारात्मक आवेशित लिपिड एक फॉस्फेट समूहों के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत बैक्टीरियल कोशिका झिल्ली को बाधित करती है जिससे अंततः कोशिका मृत्यु9,10,11,12,,13हो जाती है । कोलिस्टिन (पॉलीमाइक्सिन ई) एक अंतिम-रिसॉर्ट एंटीमाइक्रोबियल है जिसका उपयोग मल्टीड्रग प्रतिरोधी ग्राम-नकारात्मक नोसोकोमियल रोगजनकों के कारण संक्रमणों के इलाज के लिए किया जाता है, जैसे कि एसिनेटोबैक्टर बाउमैनी14,15,,16।, सबसे पहले 1947 में खोजा गया, पॉलीमाइक्सिन मिट्टी के बैक्टीरिया, पैनिबासिलस पॉलीमाइक्सा17, 18,,19,19द्वारा उत्पादित होते हैं। महत्वपूर्ण नेफ्रो और न्यूरोटॉक्सिकिटी20, 21,21की रिपोर्ट के कारण उनके नैदानिक उपयोग के सीमित होने से पहले वर्षों तक ग्राम-नकारात्मक संक्रमणों का इलाज करने के लिए पॉलीमाइक्सिन निर्धारित किए गए थे।
ए baumannii एक nosocomial ग्राम नकारात्मक रोगजनक है कि नाटकीय रूप से रुग्णता और हाल के दशकों में रोगी परिणामों की मृत्यु दर में वृद्धि हुई है22। क्या एक बार एक कम खतरे रोगजनक के रूप में माना जाता था, अब अपने अविश्वसनीय AMR प्राप्त करने की क्षमता और महामारी23, 24,24के उच्च जोखिम के कारण दुनिया भर में अस्पताल का अधिग्रहण संक्रमण के लिए एक महत्वपूर्ण जोखिम बन गया है । ए Baumannii संयुक्त राज्य अमेरिका में nosocomial संक्रमण के 10% से अधिक के लिए खातों । रोग निमोनिया, जीवाणु, मूत्र पथ संक्रमण, त्वचा और नरम ऊतक संक्रमण, दिमागी बुखार, और एंडोकार्डाइटिस25के रूप में प्रकट होता है । ए बॉमनी संक्रमण के लिए उपचार विकल्प लगभग सभी एंटीबायोटिक वर्गों के खिलाफ प्रतिरोध के कारण घट गए हैं, जिनमें β-लैक्टाम्स, फ्लोरोक्विनोलोन, टेट्रासाइक्लिन और अमीनोगलिकोसाइड्स23,,24शामिल हैं। मल्टीड्रग प्रतिरोधी, बड़े पैमाने पर दवा प्रतिरोधी और पैन-ड्रग प्रतिरोधी ए बाउमैनी आइसोले की व्यापकता ने कोलिस्टिन उपचार में पुनरुत्थान का नेतृत्व किया है, जिसे मल्टीड्रग प्रतिरोधी ए बाउमानीके खिलाफ अभी भी प्रभावी कुछ शेष चिकित्सीय विकल्पों में से एक माना जाता था। तथापि , ए. बॉमनी आइसोले के बीच कोलिस्टिन प्रतिरोध ने वैश्विक जन स्वास्थ्य 10 , 11 ,12,13,27,30,,,27,31के लिए अपना खतरा और बढ़ा दिया है ।3031
ट्रांसपोसन अनुक्रमण (टीएन-एसईक्यू) जैसी उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों में हाल की प्रगति ने विट्रो और वीवो मेंबैक्टीरियल फिटनेस की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान किए हैं। टीएन-एसईक्यू एक शक्तिशाली उपकरण है जिसे बैक्टीरिया में जीनोटाइप-फेनोटाइप इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए लीवरेज किया जा सकता है। टीएन-एसईक्यू मोटे तौर पर बैक्टीरियल रोगजनकों में लागू होता है, जहां यह पारंपरिक ट्रांसपोसन म्यूटेनेसिस को तेजी से मानचित्र प्रविष्टि साइटों के लिए बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण के साथ जोड़ती है, जिसका उपयोग डीएनए म्यूटेशन को जीनोम-वाइड स्केल32, 33,,34,,,35पर फेनोटाइपिक वेरिएंट से जोड़ने के लिए किया जा सकता है।34 जबकि ट्रांसपोसन म्यूटेनेसिस विधियों को पहले वर्णित किया गया है, सामान्य कदम समान33हैं। सबसे पहले, ट्रांसपोसन म्यूटागेनेसिस का उपयोग करके एक प्रविष्टि पुस्तकालय उत्पन्न होता है, जहां जनसंख्या के भीतर प्रत्येक जीवाणु कोशिका जीनोमिक डीएनए (gDNA) के भीतर एक ट्रांसपोसन प्रविष्टि तक सीमित है। म्यूटेनेसिस के बाद, व्यक्तिगत म्यूटेंट पूल किए जाते हैं। gDNA सम्मिलन उत्परिवर्ती पूल से निकाला जाता है और ट्रांसपोसन जंक्शनों को परिलक्षित किया जाता है और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के अधीन किया जाता है। पढ़ता सम्मिलन साइटों का प्रतिनिधित्व करता है, जिसे जीनोम में मैप किया जा सकता है। ट्रांसपोसन सम्मिलन जो फिटनेस को कम करते हैं, जल्दी से आबादी से बाहर आते हैं, जबकि लाभकारी सम्मिलन समृद्ध होते हैं। टीएन-एसईक्यू ने तनाव३३में जीन बैक्टीरियल फिटनेस को कैसे प्रभावित करते हैं, इस बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है ।
PJNW684 में एन्कोडेड हिमार 1 मेरिनर ट्रांसपोसन सिस्टम को विशेष रूप से ट्रांसपोसन म्यूटेनेसिस के उद्देश्य से बनाया और अनुकूलित किया गया था। इसमें एक मेरिनर-फैमिलीट्रांसपोसन शामिल है, जो कानमाइसिन प्रतिरोध जीन को फ्लैंक कर रहा है, जिसका उपयोग ए बाउमैनी में ट्रांसपोसन प्रविष्टि म्यूटेंट के चयन के लिए किया जाता है। यह एक ए बाउमैनी विशिष्ट प्रमोटर को भी एन्कोड करता है जो ट्रांसपोसेस एन्कोडिंग जीन36की अभिव्यक्ति को चलाता है। मेरिनर-आधारितट्रांसपोसन में कानमाइसिन प्रतिरोध जीन के डाउनस्ट्रीम में दो ट्रांसलेशनल टर्मिनेटर भी होते हैं, जो प्रविष्टि37के डाउनस्ट्रीम के माध्यम से पढ़ने से रोकता है। pJNW684 भी एक RP4/oriT/oriR6K-प्रतिकृति की सशर्त उत्पत्ति जो λpir दाता तनाव द्वारा योगदान जीन की आवश्यकता को दोहराने के लिए३८किया जाता है । λpir जीन के अभाव में, ट्रांसपोजिशन मशीनरी ले जाने वाले pJNW684 वेक्टर ए बॉमनी ,प्राप्तकर्ता तनाव10,36,38में दोहराने में सक्षम नहीं होंगे।, इसलिए, बैक्टीरियल कंजूगेशन के दौरान, प्लाज्मिड की पृष्ठभूमि प्रविष्टि के बिना प्राप्तकर्ता जीनोम में केवल ट्रांसपोसन डाला जाता है, जिसमें ट्रांसपोसेस जीन होता है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि प्लाज्मिड परिणामों के साथ ट्रांसपोसेज गतिविधि का नुकसान एकल, स्थिर पक्षांतरण घटना में होता है जो ट्रांसपोसन को प्राप्तकर्ता जीनोम में सम्मिलित करने के बाद विभिन्न स्थानों पर जाने से रोकता है।
pJNW648 भी एक और ग्राम नकारात्मक जीव, ई. कोलाईमें गतिविधि के लिए परीक्षण किया गया है । ई. कोलाई तनाव W3110 में एक संतृप्त Tn-seq पुस्तकालय की सफल विधानसभा ने संकेत दिया कि सिस्टम एंटेरोबैक्टीरिया सहित रोगजनकों की एक विस्तृत श्रृंखला में म्यूटेनेसिस करने के लिए उत्तरदायी है। इसके अलावा, ए baumannii विशिष्ट प्रमोटर है कि स्थानांतरित अभिव्यक्ति ड्राइव जल्दी से एक प्रजाति विशिष्ट प्रमोटर के साथ विमर्श किया जा सकता है । अंत में, कनामाइसिन प्रतिरोध जीन का अध्ययन किया जा रहा जीव के एएमआर फेनोटाइप के आधार पर अन्य प्रतिरोध कैसेट के लिए आदान-प्रदान किया जा सकता है।
ए बॉमनी में कोलिस्टिन प्रतिरोध में योगदान देने वाला एक कारक अपर्याप्त खुराक का प्रशासन है, जहां बैक्टीरिया गैर-घातक स्तर39पर चयनात्मक दबाव के संपर्क में हैं। कई रिपोर्टों से पता चला है कि उपनिषदीय रोगाणुरोधी सांद्रता विनियमित प्रतिक्रियाओं को प्रेरित कर सकती है जो सेल फिजियोलॉजी को बदल देती हैं ताकि संपूर्ण जीवाणु जनसंख्या11,12,30,31की संवेदनशीलता को कम कियाजा30सके । टीएन-एसईक्यू का उपयोग करके, हमने उन कारकों की खोज की जो कोलिस्टिन के अवरोधक 10 और उपभिक्षा सांद्रता के संपर्क में आने के बाद ए बॉमनी स्ट्रेन एटीसीसी17978 में कोलिस्टिन प्रतिरोध को विनियमित करते हैं। यह उदाहरण एक टीएन-सेक्यू विधि का विवरण देता है जो ट्रांसपोसंस40, 41,41के मेरिनर-आधारित परिवार का उपयोग करके संतृप्त ट्रांसपोसन उत्परिवर्तीपुस्तकालय के निर्माण और संवर्धन को सुव्यवस्थित करता है। जबकि,कई टीएन-सेक्यू प्रोटोकॉल 20,000 – 100,000 म्यूटेंट35,42,43, 44,,,1044,45,46उत्पन्न करते हैं, यहां वर्णित प्रोटोकॉल तेजी से 400,000 + म्यूटेंट की ट्रांसपोसन लाइब्रेरी उत्पन्न कर सकता है, जो मोटे तौर पर ए baumannii10 में हर 10 आधार जोड़े एक ट्रांसपोसन प्रविष्टि के बराबर है ., इसके अलावा, पुस्तकालय के आकार को महत्वपूर्ण अतिरिक्त प्रयास के बिना बढ़ाया जा सकता है। यह विधि प्रतिबंध एंडोक्यूक्लिस, एडाप्टर लिगेशन और जेल शुद्धिकरण की आवश्यकता को भी समाप्त करती है, जो अंतिम पुस्तकालय विविधता को कम कर सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ए बॉमनी वैश्विक जन स्वास्थ्य के लिए एक उभरता हुआ खतरा है, जो “अंतिम पंक्ति” चिकित्सीय के खिलाफ एएमआर के तेजी से अधिग्रहण के कारण है, जैसे कोलिस्टिन10,11,,12,,23,,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (अनुदान AI146829 से J.M.B.) के वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया था और कृतज्ञता से स्वीकार किया जाता है ।
Materials
| 10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate | Affymetrix | 77112 | |
| 100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate | Invitrogen | 10217-016 | |
| 100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker | Promega | PR-G2101 | |
| 100mm x 15mm Petri Dishes | Corning | 351029 | |
| 150mm x 15mm Petri Dishes | Corning | 351058 | |
| 1X B&W | N/A | N/A | Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W. |
| 2,6-Diaminopimelic acid | Alfa Aesar | B2239103 | used at 600 µM |
| 2X B&W | N/A | N/A | Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature. |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| 9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP | N/A | N/A | 9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C. |
| AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 12344 | |
| Acinetobacter baumannii ATCC 17978 | ATCC | N/A | AmpS, KanS |
| Ampicillin (100 mg/L) | Fisher Scientific | BP1760 | used at 100 mg/L |
| AMPure XP PCR purification system | BECKMAN COULTER | A63881 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939B | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis | Agilent | 5067-4626 | |
| Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP) | New England Biolabs (NEB) | N0447L | |
| DynaMag-2 Magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| E.coli MFD Dap- | N/A | N/A | DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36). |
| Ethanol | Fisher Scientific | A4094 | |
| Externally Threaded Cryogenic Vials | Corning | 09-761-71 | |
| Glass beads | Corning | 72684 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33 | |
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-602 | Scraping tool |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | used at 25 mg/L |
| LB agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426 | |
| LoTE | N/A | N/A | Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature. |
| Lysis buffer | N/A | N/A | 9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL) |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.) | Fisher Scientific | BP1752I | |
| Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher Scientific | BP39920 | Diluted to 1X |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33238 | |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| Sonicator with refridgerated waterbath | Qsonica Sonicators | Q2000FCE | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs (NEB) | S1420S | |
| TE buffer | N/A | N/A | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0) |
| Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt) | Promega | PR-M1875 |
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