Generera Transposon Insertion bibliotek i gramnegativa bakterier för hög genomströmning Sekvensering

Summary

Vi beskriver en metod för att generera mättande transposon mutanta bibliotek i Gram-negativa bakterier och efterföljande beredning av DNA-amplikon bibliotek för hög genomströmning sekvensering. Som ett exempel fokuserar vi på ESKAPE-patogenen, Acinetobacter baumannii, men detta protokoll är mottagligt för ett brett spektrum av gramnegativa organismer.

Abstract

Transposonsekvensering (Tn-seq) är en kraftfull metod som kombinerar transposon mutagenesis och massiv parallell sekvensering för att identifiera gener och vägar som bidrar till bakteriell kondition under en lång rad miljöförhållanden. Tn-seq-tillämpningar är omfattande och har inte bara möjliggjort undersökning av genotyp-fenotypssamband på organismnivå utan även på populations-, samhälls- och systemnivå. Gramnegativa bakterier är starkt förknippade med antimikrobiell resistens fenotyper, som har ökat incidenter av antibiotikabehandling misslyckande. Antimikrobiell resistens definieras som bakterietillväxt i närvaro av annars dödliga antibiotika. Den “sista linjen” antimikrobiella colistin används för att behandla Gramnegativa bakterieinfektioner. Flera gramnegativa patogener, inklusive Acinetobacter baumannii kan dock utveckla colistin resistens genom en rad molekylära mekanismer, av vilka några kännetecknades med hjälp av Tn-seq. Dessutom, signaltransduktion vägar som reglerar colistin resistens varierar inom Gram-negativa bakterier. Här föreslår vi en effektiv metod för transposon mutagenesis i A. baumannii som effektiviserar generering av en mättande transposon infogning bibliotek och amplikon bibliotek konstruktion genom att eliminera behovet av restriktionsenzymer, adapter ligering, och gel rening. De metoder som beskrivs häri kommer att möjliggöra djupgående analys av molekylära determinanter som bidrar till A. baumannii fitness när utmanas med colistin. Protokollet är också tillämpligt på andra gramnegativa ESKAPE-patogener, som i första hand är förknippade med läkemedelsresistenta sjukhusförvärvade infektioner.

Introduction

Upptäckten av antibiotika är utan tvekan en av de mest effektfulla^th hälsorelaterade händelserna under 1900-talet. Inte bara antibiotika snabbt lösa allvarliga bakteriella infektioner, de spelar också en central roll i modern medicin. Större operationer, transplantationer och framsteg inom neonatal medicin och kemoterapi lämna patienter mottagliga för livshotande infektioner och dessa behandlingar skulle inte vara möjligt utan antibiotika^1,2. Snabb utveckling och spridning av antibiotikaresistens bland humana patogener har dock minskat effekten betydligt av alla kliniskt viktiga klasser av antibiotika³. Många bakteriella infektioner som en gång lätt rensas med antibiotika behandling, inte längre svara på klassisk behandling protokoll, orsakar ett allvarligt hot mot den globala folkhälsan¹. Antimikrobiell resistens (ANTIMIKR) är där bakterieceller växer i övrigt dödliga koncentrationer av antibiotika, oavsett behandlingstid^4,5. Det finns ett akut behov av att förstå molekylära och biokemiska faktorer som reglerar antis, vilket kommer att hjälpa till att styra alternativ antimikrobiell utveckling. Specifikt är ESKAPE patogener problematiska i kliniska miljöer och i samband med omfattande AMR. Dessa inkluderar Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa och Enterobacter spp. Medan flera mekanismer bidrar till AMR i ESKAPE patogener, de fyra sistnämnda organismerna är Gram-negativa.

Gramnegativa bakterier monterar ett definierande yttre membran som skyddar dem från ogynnsamma miljöförhållanden. Det yttre membranet fungerar som en permeabilitet barriär för att begränsa inträde av giftiga molekyler, såsom antibiotika, i cellen. Till skillnad från andra biologiska membran är det yttre membranet asymmetriskt. Den yttre bipacksedeln är berikad med ytexponerad lipopolysackarid, medan den inre bipacksedeln är en blandning av fosfolipider⁶. Lipopolysackaridmolekyler förankras i det yttre membranet av en bevarad lipid A moiety inbäddad i lipid bilayer⁷. Den kanoniska lipid En domän av Escherichia coli lipopolysackarid krävs för tillväxten av de flesta Gram-negativa bakterier och syntetiseras av en nio-stegs enzymatisk väg som är en av de mest grundläggande och bevarade vägar i Gram-negativa organismer^6,7,8.

Polymyxiner är katjoniska antimikrobiella peptider som riktar sig mot lipopolysackaridens lipopolysackarids domän för att perturb det yttre membranet och lysa cellen. Den elektrostatiska interaktionen mellan positivt laddade rester av polymyxiner och de negativt laddade lipiden A fosfatgrupper stör bakteriecellmembranet vilket i slutändan leder till celldöd^{9,10,11,12,13}. Colistin (polymyxin E) är en sista utväg antimikrobiell används för att behandla infektioner orsakade av multiresistenta Gram-negativa nosokomiala patogener, såsom Acinetobacter baumannii^14,15,16. Först upptäcktes i 1947, polymyxiner produceras av jorden bakterier, Paenibacillus polymyxa^17,18,19. Polymyxiner ordinerades för att behandla Gramnegativa infektioner i flera år innan deras kliniska användning var begränsad på grund av rapporter om betydande nefro- och neurotoxicitet^20,21.

A. baumannii är en nosokomna Gramnegativ patogen som dramatiskt har ökat sjuklighet och dödlighet av patientens resultat under de senaste decennierna²². Vad som en gång betraktades som en låg hot-patogen, utgör nu en betydande risk för sjukhus-förvärvade infektion i hela världen på grund av dess otroliga förmåga att förvärva AMR och hög risk för^{epidemiska 23,24}. A. baumannii står för mer än 10% av nosokomna infektioner i USA. Sjukdom yttrar sig som lunginflammation, bakteremi, urinvägsinfektioner, hud och mjukdelar infektioner, hjärnhinneinflammation, och endokardit²⁵. Behandlingsalternativ för A. baumannii infektioner har krympt på grund av resistens mot nästan alla antibiotiska klasser, inklusive β-laktamer, fluorokinoloner, tetracyklin, och aminoglykosiderna^23,24. Prevalensen av multiresistenta, i stor utsträckning läkemedelsresistenta och pan-resistentA A. baumannii isolat har lett till ett uppsving i colistin behandling, som ansågs vara en av de få återstående terapeutiska alternativ fortfarande effektiv mot multidrug resistenta A. baumannii. Ökat colistinmotstånd bland A. baumannii-isolat har dock ytterligare förstärkt sitt hot mot den globala folkhälsan^{10,11,12,13,27,30,31}.

Den senaste tidens framsteg inom sekvenseringsteknik med hög genomströmning, såsom transponeringssekvensering (Tn-seq), har tillhandahållit viktiga verktyg för att främja vår förståelse av bakteriell kondition in vitro och in vivo. Tn-seq är ett kraftfullt verktyg som kan utnyttjas för att studera genotyp-fenotyp interaktioner i bakterier. Tn-seq är i stort sett tillämpligt över bakteriella patogener, där den kombinerar traditionell transposon mutagenesis med massiv parallell sekvensering för att snabbt kartlägga insättningsplatser, som kan användas för att länka DNA-mutationer till fenotypiska varianter på en genom-bred skala^32,33,34,35. Medan transposon mutagenesis metoder har tidigare beskrivits, de allmänna stegen är liknande³³. Först genereras ett infogningsbibliotek med hjälp av transposon mutagenes, där varje bakteriecell inom en population begränsas till en enda transposoninfogning inom det genomiska DNA (gDNA). Efter mutagenesis, enskilda mutanter är poolade. gDNA extraheras från infogningsmutsadpoolen och transponeringspunkterna förstärks och utsätts för sekvensering med hög genomströmning. Läsningen representerar infogningsplatser, som kan mappas till genomet. Transposoninfogningar som minskar konditionen faller snabbt ut ur populationen, medan välgörande infogningar berikas. Tn-seq har varit avgörande för att främja vår förståelse av hur gener påverkar bakteriell kondition i stress³³.

Den Himar1 mariner transposon systemet kodade i pJNW684 var särskilt konstruerade och optimerade för syftet med transposon mutagenesis. Det inkluderar en mariner-familj transposon flankerande kanamycin resistens genen, som används för val av transposon insättningsmutanter i A. baumannii. Det kodar också en A. baumannii specifik promotor som driver uttryck för transposas kodning genen³⁶. Den mariner-baserade transposon innehåller också två translationella terminators nedströms kanamycin resistens genen, vilket förhindrar genomläsning nedströms införandet³⁷. pJNW684 bär också en RP4/oriT/oriR6K-villkorligt ursprung replikation som kräver λpir genen bidragit med givaren stam att replikera³⁸. I avsaknad av λpir-genen kommer den pJNW684-vektor som bär på införlivandemaskineriet inte att kunna replikera i A. baumannii-mottagarens ^{stam 10,36,38}. Vid bakteriekonjugation förs därför endast transposon in i mottagargenomet utan bakgrundsinsättning av plasmiden, som bär transposasgenen. Detta är signifikant eftersom förlusten av transposasaktivitet tillsammans med plasmiden resulterar i enstaka, stabil införlivande händelse som hindrar transposon från att flytta till olika platser när den sätter in i mottagarens genom.

pJNW648 har också testats för aktivitet i en annan Gramnegativ organism, E. coli. Framgångsrik montering av en mättande Tn-seq bibliotek i E. coli stam W3110 anges systemet är mottagliga för att utföra mutagenesis i ett brett spektrum av patogener, inklusive Enterobacteriaceae. Vidare kan den särskilda promotorn A. baumannii som driver transposasuttryck snabbt utbytas med en artspecifik promotor. Slutligen kan kanamycin resistens genen bytas ut mot andra motstånd kassetter, beroende på AMR fenotyp av organismen studeras.

En faktor som bidrar till kolistinsistens i A. baumannii är administrering av otillräckliga doser, där bakterier utsätts för selektivt tryck vid icke-dödliga nivåer³⁹. Flera rapporter visade att subinhibitory antimikrobiella koncentrationer kan inducera reglerade svar som förändrar cellfysiologi för att minska mottagligheten för hela^{bakteriepopulationen 11,12,30,31}. Använda Tn-seq upptäckte vi faktorer som reglerar colistin resistens i A. baumannii stam ATCC 17978 efter exponering för^{hämmande 10} och subinhibitory koncentrationer av colistin. Det här exemplet beskriver en Tn-seq-metod som effektiviserar konstruktion och berikning av ett mättat transposon mutantbibliotek med hjälp av den mariner-baserade familjen av transposoner^40,41. Medan flera Tn-seq protokoll generera 20.000 – 100.000 mutanter^{35,42,43,44,45,46}, protokollet som beskrivs häri kan snabbt generera en transposon bibliotek av 400.000 + mutanter, vilket ungefär motsvarar en transposoninsättning varje 10-baspar i A. baumannii¹⁰. Vidare kan bibliotekets storlek skalas upp utan betydande ytterligare ansträngning. Denna metod eliminerar också kravet på begränsning endonucéer, adapter ligering och gel rening, vilket kan minska slutliga biblioteket mångfald.

Protocol

1. Beredning av bakteriell stam Strimma “givaren” stam (E. coli MFD DAP-/pJNW684, Tabell of Materials) för isolerade kolonier på Luria-Bertani agar kompletteras med 600 μM diaminopimelsyra (DAP), 100 mg/L av ampicillin och 25 mg/L av kanamycin. Inkubera över natten vid 37 °C. Med hjälp av en enda isolerad koloni, inokulera 50 mL Luria buljong (LB) kompletteras med 600 μM DAP, 100 mg/L av ampicillin och 25 mg/L av kanamycin i en 250 mL Erlenmeyer kolv och märka den s…

Representative Results

De skisserade metoderna beskriver genereringen av ett högdensitets transposonbibliotek i A. baumanniistam ATCC 17978 genom bakteriekonjugering med hjälp av E. coli MFD DAP-, som replikerar plasmiden pJNW684 (Figur 4B). Det detaljerade protokollet använder bi-föräldrarnas bakteriella konjugation för överföring av pJNW684 från E. coli λpir+ givaren stam till A. baumannii mottagaren stam. Detta är en effektiv och billig metod f…

Discussion

A. baumannii är ett framväxande hot mot den globala folkhälsan på grund av det snabba förvärvet av ANTIR mot “sista linjen” therapeutics, såsom colistin^{10,11,12,23,24,30,31}. Under de senaste decennierna, Tn-seq har spelat en avgörande roll i att belysa genotyp-fenotyp intera…

Materials

10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate	Affymetrix	77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate	Invitrogen	10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker	Promega	PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351029
150mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351058
1X B&W	N/A	N/A	Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid	Alfa Aesar	B2239103	used at 600 µM
2X B&W	N/A	N/A	Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP	N/A	N/A	9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)	Fisher Scientific	BP1760	used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system	BECKMAN COULTER	A63881
BioAnalyzer	Agilent	G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis	Agilent	5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP)	New England Biolabs (NEB)	N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack	Invitrogen	12321D
E.coli MFD Dap-	N/A	N/A	DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol	Fisher Scientific	A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials	Corning	09-761-71
Glass beads	Corning	72684
Glycerol	Fisher Scientific	G33
Inoculating loops	Fisher Scientific	22-363-602	Scraping tool
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906	used at 25 mg/L
LB agar, Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426
LoTE	N/A	N/A	Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer	N/A	N/A	9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.)	Fisher Scientific	BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher Scientific	BP39920	Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33238
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher	Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath	Qsonica Sonicators	Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs (NEB)	S1420S
TE buffer	N/A	N/A	10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)	Promega	PR-M1875