Génération de bibliothèques d’insertion transposon dans les bactéries gramnégatives pour le séquençage à haut débit

Summary

Nous décrivons une méthode pour générer des bibliothèques mutantes transposons saturantes chez les bactéries gramnégatives et la préparation subséquente des bibliothèques d’amiplicons d’ADN pour le séquençage à haut débit. À titre d’exemple, nous nous concentrons sur l’agent pathogène ESKAPE, Acinetobacter baumannii, mais ce protocole est accessible à un large éventail d’organismes gramnégatifs.

Abstract

Le séquençage de transposon (Tn-seq) est une méthode puissante qui combine la mutagenèse transposon et le séquençage parallèle massif pour identifier les gènes et les voies qui contribuent à la condition physique bactérienne dans un large éventail de conditions environnementales. Les applications Tn-seq sont étendues et ont non seulement permis l’examen des relations génotype-phénotype au niveau de l’organisme, mais aussi au niveau de la population, de la communauté et des systèmes. Les bactéries gramnégatives sont fortement associées aux phénotypes de résistance aux antimicrobiens, ce qui a augmenté les incidents d’échec du traitement antibiotique. La résistance aux antimicrobiens est définie comme une croissance bactérienne en présence d’antibiotiques autrement mortels. La colistine antimicrobienne de « dernière ligne » est utilisée pour traiter les infections bactériennes gramnégatives. Cependant, plusieurs agents pathogènes gramnégatifs, dont Acinetobacter baumannii, peuvent développer une résistance à la colistine par le biais d’une gamme de mécanismes moléculaires, dont certains ont été caractérisés à l’aide de Tn-seq. En outre, les voies de transduction de signal qui régulent la résistance à la colistine varient au sein des bactéries gram-négatives. Nous proposons ici une méthode efficace de transpsine mutagenesis dans A. baumannii qui simplifie la génération d’une bibliothèque d’insertion de transposon saturé et la construction de bibliothèque d’amplicon en éliminant la nécessité d’enzymes de restriction, de ligature d’adaptateur et de purification de gel. Les méthodes décrites dans le présent mécanisme permettront une analyse approfondie des déterminants moléculaires qui contribuent à la condition physique de A. baumannii lorsqu’elles sont confrontées à la colistine. Le protocole s’applique également à d’autres agents pathogènes Gram-négatifs de l’ESKAPE, qui sont principalement associés à des infections nosocomiales résistantes auxmédicaments.

Introduction

La découverte d’antibiotiques est sans aucun doute l’un des événements les plus importants liés à la santé du^XXe siècle. Non seulement les antibiotiques résolvent rapidement les infections bactériennes graves, mais ils jouent également un rôle central dans la médecine moderne. Les chirurgies majeures, les transplantations et les progrès de la médecine néonatale et de la chimiothérapie laissent les patients vulnérables aux infections potentiellement mortelles et ces thérapies ne seraient pas possibles sans antibiotiques^1,2. Cependant, le développement rapide et la propagation de la résistance aux antibiotiques chez les agents pathogènes humains ont considérablement diminué l’efficacité de toutes les classes cliniquement importantes d’antibiotiques³. De nombreuses infections bactériennes qui étaient autrefois facilement éliminées par un traitement antibiotique ne répondent plus aux protocoles de traitement classiques, ce qui constitue une grave menace pour la santé publique mondiale¹. La résistance aux antimicrobiens (AMR) est l’endroit où les cellules bactériennes se développent dans des concentrations autrement mortelles d’antibiotiques, quelle que soit la durée du traitement^4,,5. Il est urgent de comprendre les facteurs moléculaires et biochimiques qui régulent la DMM, ce qui aidera à orienter le développement d’autres antimicrobiens. Plus précisément, les agents pathogènes de l’ESKAPE sont problématiques en milieu clinique et associés à une VASTE DMA. Il s’agit notamment Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa et Enterobacter spp. Bien que plusieurs mécanismes contribuent à l’AMR chez les agents pathogènes de l’ESKAPE, les quatre derniers organismes sont gramnégatifs.

Les bactéries gramnégatives assemblent une membrane extérieure qui les protège des conditions environnementales défavorables. La membrane externe sert de barrière de perméabilité pour limiter l’entrée de molécules toxiques, comme les antibiotiques, dans la cellule. Contrairement à d’autres membranes biologiques, la membrane externe est asymétrique. La notice extérieure est enrichie de lipopolysaccharide exposé à la surface, tandis que la notice interne est un mélange de phospholipides⁶. Les molécules de lipopolysaccharide sont ancrées à la membrane externe par un lipide conservé A moiety intégré dans la bicouche lipidique⁷. Le lipide canonique Un domaine d’Escherichia coli lipopolysaccharide est nécessaire pour la croissance de la plupart des bactéries gramnégatives et est synthétisé par une voie enzymatique en neuf étapes qui est l’une des voies les plus fondamentales et conservées dans les organismes gramnégatifs^6,7,8.

Les polymyxines sont des peptides antimicrobiens cationiques qui ciblent le lipide Un domaine de lipopolysaccharide pour perturber la membrane externe et lyser la cellule. L’interaction électrostatique entre les résidus chargés positivement des polymyxines et les groupes de phosphate de lipides chargés négativement A perturbent la membrane cellulaire bactérienne menant finalement à la mort cellulaire^{9,10,11,12,13}. Colistin (polymyxine E) est un antimicrobien de dernier recours utilisé pour traiter les infections causées par des agents pathogènes nosocomiques gramnégatifs multirésistants, tels que Acinetobacter baumannii^14,15,16. Découvertes pour la première fois en 1947, les polymyxines sont produites par les bactéries du sol, Paenibacillus polymyxa^17,18,19. Les polymyxines ont été prescrites pour traiter les infections gramnégatives pendant des années avant que leur utilisation clinique ait été limitée en raison des rapports de nephro- et de neurotoxicité^{significatives 20,21}.

A. baumannii est un agent pathogène gramnégatif nosocomial qui a considérablement augmenté la morbidité et la mortalité des résultats des patients au cours des dernières décennies²². Ce qui était autrefois considéré comme un agent pathogène de faible menace, pose maintenant un risque important pour l’infection acquise à l’hôpital dans le monde entier en raison de son incroyable capacité à acquérir AMR et à haut risque d’épidémie^23,24. A. baumannii représente plus de 10 % des infections nosocomiales aux États-Unis. La maladie se manifeste comme pneumonie, bactériémie, infections urinaires, infections de la peau et des tissus mous, méningite et endocardite²⁵. Les options de traitement pour les infections à A. baumannii ont diminué en raison de la résistance contre presque toutes les classes d’antibiotiques, y compris les β-lactams, fluoroquinolones, tétracycline, et aminoglycosides^23,24. La prévalence des isolats multirésistants, résistants aux médicaments et panrésistants A. baumannii a conduit à une résurgence du traitement de la colistine, qui a été considéré comme l’une des rares options thérapeutiques restantes encore efficace contre multirésistant A. baumannii. Cependant, la résistance accrue à la colistine chez les isolats A. baumannii a encore amplifié sa menace pour la santé publique mondiale^{10,11,12,13,27,30,31}.

Les progrès récents dans les technologies de séquençage à haut débit, telles que le séquençage de transposition (Tn-seq), ont fourni des outils importants pour faire progresser notre compréhension de la condition physique bactérienne in vitro et in vivo. Tn-seq est un outil puissant qui peut être utilisé pour étudier les interactions génotype-phénotype chez les bactéries. Tn-seq est largement applicable à travers les pathogènes bactériens, où il combine la mutagenèse transposon traditionnelle avec le séquençage parallèle massif aux sites d’insertion de carte rapide, qui peuvent être utilisés pour relier les mutations d’ADN à des variantes phénotypiques sur une échelle^32,33,34,35. Bien que les méthodes de mutagenesis transposon aient été précédemment décrites, les étapes générales sont similaires³³. Tout d’abord, une bibliothèque d’insertion est générée à l’aide de la mutagenèse transposon, où chaque cellule bactérienne d’une population est limitée à une seule insertion de transposon dans l’ADN génomique (ADNG). Après la mutanéèse, les mutants individuels sont mis en commun. gDNA est extrait de la piscine mutante d’insertion et les jonctions transposons sont amplifiées et soumises au séquençage à haut débit. Les lectures représentent des sites d’insertion, qui peuvent être cartographiés au génome. Les insertions transposons qui réduisent la condition physique tombent rapidement hors de la population, tandis que les insertions bénéfiques sont enrichies. Tn-seq a joué un rôle déterminant pour faire progresser notre compréhension de l’impact des gènes sur la condition physique bactérienne dans le stress³³.

Le système de transposon marin Himar1 codé en pJNW684 a été spécialement construit et optimisé aux fins de transposon mutagenesis. Il comprend un transposon de la famille des marinsflanquant le gène de résistance à la kanamycine, qui est utilisé pour la sélection des mutants d’insertion transposon dans A. baumannii. Il code également un promoteur spécifique A. baumannii qui conduit à l’expression du gène d’encodage transposase³⁶. Le transposon basé sur le marincontient également deux terminateurs translationnels en aval du gène de résistance à la kanamycine, ce qui empêche la lecture en aval de l’insertion³⁷. pJNW684 porte également une RP4/oriT/oriR6K-origine conditionnelle de la réplication qui exige le gène λpir contribué par la souche de donneur pour reproduire³⁸. En l’absence du gène λpir, le vecteur pJNW684 transportant la machine de transposition ne sera pas en mesure de se répliquer dans la souche bénéficiaire A. baumannii ^10,36,38. Par conséquent, lors de la conjugaison bactérienne, seul le transposon est inséré dans le génome receveur sans insertion de fond du plasmide, qui porte le gène transposase. Ceci est significatif parce que la perte de l’activité transposase avec le plasmide se traduit par un seul événement de transposition stable qui empêche le transposon de se déplacer à différents endroits une fois qu’il s’insère dans le génome du receveur.

pJNW648 a également été testé pour l’activité dans un autre organisme gram-négatif, E. coli. L’assemblage réussi d’une bibliothèque saturée de Tn-seq dans la souche W3110 de E. coli a indiqué que le système est susceptible d’effectuer la mutagènesis dans un large éventail d’agents pathogènes, y compris les entérobactéries. En outre, le promoteur spécifique A. baumannii qui conduit l’expression transposase peut rapidement être échangé avec un promoteur spécifique à l’espèce. Enfin, le gène de résistance à la kanamycine peut être échangé contre d’autres cassettes de résistance, selon le phénotype AMR de l’organisme étudié.

Un facteur qui contribue à la résistance à la colistine dans A. baumannii est l’administration de doses insuffisantes, où les bactéries sont exposées à une pression sélective à des niveaux non létaux³⁹. Plusieurs rapports ont montré que les concentrations antimicrobiennes de subinhibitoire peuvent induire des réponses réglementées qui modifient la physiologie cellulaire pour réduire la susceptibilité de l’ensemble de la population bactérienne^11,12,30,31. En utilisant Tn-seq, nous avons découvert des facteurs qui régulent la résistance à la colistine dans la souche A. baumannii ATCC 17978 après l’exposition aux concentrations inhibitrices¹⁰ et subinhibitoires de colistine. Cet exemple détaille une méthode Tn-seq qui simplifie la construction et l’enrichissement d’une bibliothèque mutante transposon saturée à l’aidede la famille de transposons^40,41. Alors que plusieurs protocoles Tn-seq génèrent 20.000 – 100.000 mutants^{35,42,43,44,45},^46,le protocole décrit ci-après peut rapidement générer une bibliothèque transposon de 400.000 + mutants, ce qui équivaut à peu près à une insertion transposon toutes les paires de 10 bases dans A. baumannii¹⁰. En outre, la taille de la bibliothèque peut être réduite sans effort supplémentaire significatif. Cette méthode élimine également l’exigence de restriction endonuclées, la ligature d’adaptateur et la purification de gel, qui peut réduire la diversité finale de bibliothèque.

Protocol

1. Préparation de la souche bactérienne Streak de la souche « onair » (E. coli MFD DAP-/pJNW684, Table of Materials) pour les colonies isolées sur luria-Bertani agar complétée par 600 μM d’acide diaminopimélique (DAP), 100 mg/L d’ampicilline et 25 mg/L de kanamycine. Incuber toute la nuit à 37 °C. À l’aide d’une seule colonie isolée, inoculer 50 ml de bouillon de Luria (LB) complétés par 600 μM DAP, 100 mg/L d’ampicilline et 25 mg/L de kanamycine d…

Representative Results

Les méthodes décrites décrivent la génération d’une bibliothèque transposon à haute densité dans la souche A. baumannii ATCC 17978 par conjugaison bactérienne à l’aide de E. coli MFD DAP-, qui reproduit le plasmid pJNW684 (Figure 4B). Le protocole détaillé utilise la conjugaison bactérienne biparentale pour le transfert de pJNW684 de la souche E. coli λpir+ donneur à la souche receveur A. baumannii. Il s’agit d’…

Discussion

A. baumannii est une menace émergente pour la santé publique mondiale en raison de l’acquisition rapide d’AMR contre les thérapeutiques de « dernière ligne », telles que la colistine^{10,11,12,23,24,30,31}. Au cours des dernières décennies, Tn-seq a joué un rôle crucial d…

Materials

10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate	Affymetrix	77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate	Invitrogen	10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker	Promega	PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351029
150mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351058
1X B&W	N/A	N/A	Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid	Alfa Aesar	B2239103	used at 600 µM
2X B&W	N/A	N/A	Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP	N/A	N/A	9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)	Fisher Scientific	BP1760	used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system	BECKMAN COULTER	A63881
BioAnalyzer	Agilent	G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis	Agilent	5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP)	New England Biolabs (NEB)	N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack	Invitrogen	12321D
E.coli MFD Dap-	N/A	N/A	DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol	Fisher Scientific	A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials	Corning	09-761-71
Glass beads	Corning	72684
Glycerol	Fisher Scientific	G33
Inoculating loops	Fisher Scientific	22-363-602	Scraping tool
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906	used at 25 mg/L
LB agar, Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426
LoTE	N/A	N/A	Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer	N/A	N/A	9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.)	Fisher Scientific	BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher Scientific	BP39920	Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33238
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher	Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath	Qsonica Sonicators	Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs (NEB)	S1420S
TE buffer	N/A	N/A	10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)	Promega	PR-M1875