मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल से मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं का व्युत्पन्न, विस्तार, क्रायोप्रिजर्वेशन और लक्षण वर्णन
Summary
यह प्रोटोकॉल मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं में अंतर करके प्राप्त मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को प्राप्त करने, विस्तार और क्रायोप्रिजर्वर करने के लिए एक अनुकूलित विधि का विवरण देता है, और एक पूर्व वीवो मॉडल में रक्त मस्तिष्क बाधा गुणों का अध्ययन करने के लिए।
Abstract
मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (बीएमईसी) को रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) समारोह का अध्ययन करने के लिए पूर्व वीवो सेलुलर मॉडल विकसित करने के लिए मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) से अलग किया जा सकता है। यह संशोधित प्रोटोकॉल पिछले प्रोटोकॉलों की रिपोर्ट की तुलना में एक अलग दाता और अभिकर्मकों का उपयोग करके मानव आईपीएससी से बीएमईसी को प्राप्त करने, विस्तारित करने और क्रायोप्रिजर्व करने के लिए विस्तृत कदम प्रदान करता है। आईपीएससी को 4 दिनों के लिए आवश्यक 6 माध्यम के साथ इलाज किया जाता है, इसके बाद 2 दिनों के मानव एंडोथेलियल सीरम-मुक्त संस्कृति माध्यम को बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर, रेटिनोइक एसिड और बी 27 पूरक के साथ पूरक किया जाता है। 6 दिन में, कोशिकाओं को 2 दिनों के लिए एक कोलेजन/फाइब्रोनेक्टिन मैट्रिक्स पर उप-संस्कारी होते हैं । इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, और SLC2A1 का उपयोग कर बीएमईसी मार्कर विश्लेषण के लिए 8 दिन में किया जाता है। पश्चिमी ब्लॉटिंग बीएमईसी मार्कर अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए किया जाता है, और SOX17 की अनुपस्थिति, एक एंडोडर्मल मार्कर। एंजियोजेनिक क्षमता एक अंकुरण परख के साथ प्रदर्शन किया है। ट्रांस एंडोथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर) को 7 दिन से शुरू होने वाले चॉपस्टिक इलेक्ट्रोड और वोल्टोममीटर का उपयोग करके मापा जाता है। एटीपी बाध्यकारी कैसेट उपपरिवार बी सदस्य 1 और एटीपी बाध्यकारी कैसेट उपपरिवार सी सदस्य 1 के लिए Efflux ट्रांसपोर्टर गतिविधि 8 दिन में एक बहु प्लेट रीडर का उपयोग कर मापा जाता है । बीएमईसी के सफल व्युत्पन्न की पुष्टि प्रासंगिक सेल मार्कर, SOX17 के निम्न स्तर, एंजियोजेनिक क्षमता, ट्रांसपोर्टर गतिविधि और टीईईआर मूल्यों की उपस्थिति से होती है ~ 2000 Ω एक्स सेमी2। बीएमईसी का विस्तार 10 दिन तक किया जाता है, जो हौसले से लेपित कोलेजन/फाइब्रोनेक्टिन प्लेटों या क्रायोप्रेसेव पर पासिंग से पहले होता है । यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी का विस्तार किया जा सकता है और कम से कम एक बार पारित किया जा सकता है। हालांकि, क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद कम टीईईआर मूल्यों और बीएमईसी मार्कर के गरीब स्थानीयकरण को देखा गया। बीएमईसी का उपयोग मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड के संवहनी के लिए, और न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारोंमें बीबीबी रोग का अध्ययन करने के लिए, त्रि-आयामी मस्तिष्क मॉडल (अंग-चिप और हाइड्रोजेल) में अन्य सेल प्रकारों (न्यूरॉन्स, ग्लिया, पेरिसाइट्स) के साथ सह-संस्कृति प्रयोगों में उपयोग किया जा सकता है।
Introduction
रक्त-मस्तिष्क बाधा समारोह
रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) एक सीमा बनाती है जो रक्त से मस्तिष्क तक पदार्थों के आंदोलन को सीमित करती है। बीबीबी में मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं (बीएमईसी) शामिल हैं जो वैक्यूलेचर को अस्तर करने वाला मोनोलेयर बनाती हैं। बीएमईसी, एस्ट्रोसाइट्स, न्यूरॉन्स, पेरिसाइट्स, माइक्रोग्लिया और एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स के साथ मिलकर न्यूरोवैस्कुलर यूनिट बनाते हैं। बीएमईसी में एक कसकर विनियमित पैरासेलुलर संरचना होती है जो बीबीबी को उच्च ट्रांस-एंडोथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर) बनाए रखने की अनुमति देती है, जो निष्क्रिय प्रसार को सीमित करती है और बाधा अखंडता1,2के संकेतक के रूप में कार्य करती है। बीएमईसी में प्रोटीन भी होता है जो ट्रांससेलुलर मूवमेंट जैसे एंडोसाइटोसिस, ट्रांससाइटोसिस और ट्रांसमिग्रेशन के साथ-साथ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 3 केदौरानल्यूकोसाइट्स के अपव्यय के साथ सहायता करता है। बीएमईसी मस्तिष्क3में एक होमोस्टेटिक संतुलन बनाए रखने के लिए अपशिष्ट उत्पादों के पोषण और हटाने के लिए बाढ़ और efflux ट्रांसपोर्टरों पर भरोसा करते हैं। उदाहरण के लिए, सोल्यूट कैरियर परिवार 2 सदस्य 1 (SLC2A1) बीबीबी4में ग्लूकोज के आंदोलन के लिए जिम्मेदार एक बाढ़ ट्रांसपोर्टर है, जबकि एटीपी बाध्यकारी कैसेट सबफैमिली बी सदस्य 1 (एबीसीबी 1) और एटीपी बाध्यकारी कैसेट सबफैमिली सी सदस्य 1 (ABCC1) जैसे एफ्लक्स ट्रांसपोर्टर रक्त धारा3,5,6, 7,7, 7मेंवापस सबट्रेट्स लौटाने के लिए जिम्मेदार हैं। एबीसीबी 1 सब्सट्रेट्स में मॉर्फिन, वेरापामिल4और एंटीसाइकोटिक्स जैसे ओलान्ज़ाइन और रिस्पेरिडोन8शामिल हैं, जबकि एबीसीसी 1 ट्रांसपोर्टर में सल्फेट कंजूगेट्स, विनक्रिस्टीन और ग्लूक्यूरोनाइड संजुगेट्स4सहित कई तरह के सब्सट्रेट्स हैं ।
मनोरोग विकारों में बीबीबी मॉडल का आवेदन
बीबीबी डिसफंक्शन को कई न्यूरोलॉजिकल और मनोरोग विकारों में फंसाया गया है, जिसमें सिजोफ्रेनिया और बाइपोलर डिसऑर्डर9,10शामिल हैं । हाल ही में, मनोरोग विकारों के सेलुलर और आणविक आधार पर पूछताछ करने के लिए आईपीएससी-व्युत्पन्न पूर्व वीवो सेलुलर मॉडल का उपयोग किया जा रहा है, लेकिन ये मॉडल वर्तमान में न्यूरोवैस्कुलेचर11,12, 13द्वारा निभाई गई संभावित भूमिका को ध्यान में नहींरखतेहैं। यह परिकल्पना की गई है कि रक्त में घूम रहे परिधीय भड़काऊ साइटोकिन्स बीबीबी14, 15,16,17पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकतेहैं,लेकिन पैरासेलुलर18,19,20, 21केलिए भी सबूतहैं।22,ट्रांससेलुलर23,24,25,26,27,28, 29,और एक्सेसेलुलर मैट्रिक्स20, 29,30,31,32 असामान्यताओं बीबीबी रोग में योगदान देते हैं। बीबीबी के व्यवधान के परिणामस्वरूप मस्तिष्क परेन्चिमा में प्रवेश करने वाले रक्त की सामग्री हो सकती है और एस्ट्रोसाइट्स और/या माइक्रोग्लिया को प्रोइनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स जारी करने के लिए सक्रिय किया जा सकता है, जो बदले में एक भड़काऊ प्रतिक्रिया३३ शुरू करता है जो मस्तिष्क३४पर हानिकारक प्रभाव डाल सकता है । बीएमईसी बीबीबी का प्राथमिक घटक है और इन कोशिकाओं की संरचना और कार्य की जांच न्यूरोलॉजिकल और मनोरोग विकारों में बीबीबी रोग की समझ को बढ़ा सकता है।
वैकल्पिक बीएमईसी मॉडल
आईपीएससी1, 6,35,36से बीएमईसी प्राप्त करने के लिए कुशल प्रोटोकॉल के विकास से पहले, शोधकर्ताओं ने बीबीबी समारोह का अध्ययन करने के लिए अमरबीएमईसी 37 को नियोजित किया था। हालांकि, इनमें से कई मॉडल वांछनीय बीबीबी फेनोटाइप प्राप्त करने में विफल रहे, टीईईआर मूल्यों की ऐसी शारीरिक श्रृंखला38,39। आईपीएससी का उपयोग करने से उस व्यक्ति की आनुवंशिक पृष्ठभूमि को बनाए रखने का लाभ होता है जिससे कोशिकाएं प्राप्त होती हैं। वैज्ञानिक सक्रिय रूप से आईपीएससी-व्युत्पन्न पूर्व वीवो माइक्रोएनवायरमेंट मॉडल स्थापित करने पर काम कर रहे हैं जो मानव मस्तिष्क की संरचना और कार्य को पुनः स्थापित करते हैं । शोधकर्ताओं ने बीएमईसी प्राप्त करने के तरीके विकसित किए हैं जो संरचनात्मक रूप से और शारीरिक रूप से वीवो मेंपाए जाने वाले बीएमईसी के समान हैं । आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी की शुद्ध आबादी प्राप्त करने के तरीकों के लिए पिछले कुछ वर्षों में 1 ,6, 35,36के प्रोटोकॉल के साथ कई अलग – अलग कदमों की आवश्यकता होती है। आम तौर पर, आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी को 4 दिनों के लिए आवश्यक 6 (ई6) माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है, इसके बाद मानव एंडोथेलियल सीरम-मुक्त माध्यम (एचईएफएम) में 2 दिन बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएमएफजीएफ), रेटिनोइक एसिड (आरए) और बी 27 पूरक के साथ पूरक होते हैं। कोशिकाओं को तब कोलेजन IV (COL4) और फाइब्रोनेक्टिन (एफएन) मैट्रिक्स पर सुसंस्कृत किया जाता है ताकि प्राप्त किया जा सके और 90% सजातीय बीएमईसी1प्राप्त किया जा सके।
बीएमईसी की पहचान इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा पुष्टि की जाती है जिसमें प्लेटलेट-एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु-1 (PECAM1), SLC2A1, और तंग जंक्शन प्रोटीन जैसे टाइट जंक्शन प्रोटीन 1 (टीजेपी1), ओक्लुडिन (ओसीएलएन), और क्लाउडिन-5 (CLDN5)6सहित बीएमईसी प्रोटीन की सह-अभिव्यक्ति दिखाई जाती है । स्प्राउटिंग परख का उपयोग आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी की एंजियोजेनिक क्षमता की पुष्टि करने के लिए किया गया है। 6 बीएमईसी की बीबीबी अखंडता का मूल्यांकन फिजियोलॉजिकल इन विट्रो टीयर वैल्यूज (~2000ω एक्स सेमी2) 37और एबीसीबी 1 और एबीसीसी1,6,36 जैसे एफफ्लक्स ट्रांसपोर्टर्स के लिए मापने योग्य गतिविधि की उपस्थिति से कियाजाताहै । लिपमैन समूह द्वारा हाल ही में किए गए पद्धतिगत अग्रिमों ने कम प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता और बढ़ी हुई प्रजनन क्षमता1के साथ आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी प्रोटोकॉल का नेतृत्व किया है। हालांकि, यह ज्ञात नहीं है कि क्या उनका विस्तार किया जा सकता है और उप-संस्कृति चरण से परे है। हमारे संशोधित प्रोटोकॉल का उद्देश्य 8 दिन से परे आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी को पास करके इस मुद्दे का समाधान करना और यह आकलन करना है कि क्या क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद बीबीबी संपत्तियों को बनाए रखने के लिए उन्हें और विस्तारित किया जा सकता है। हालांकि किसी भी अध्ययन में आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी के पास्डिंग का वर्णन नहीं किया गया है, लेकिन बीएमईसी क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है जो फ्रीज-गल चक्र40से गुजरने के बाद शारीरिक बीबीबी गुणों को बरकरार रखता है। हालांकि, यह ज्ञात नहीं है कि क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद बीएमईसी को पारित किया जा सकता है और बीबीबी गुणों को बनाए रखा जा सकता है।
लिपमैन प्रोटोकॉल का उपयोग करके आईपीएससी से प्राप्त बीएमईसी का उपयोग हंटिंगटन रोग7जैसे न्यूरोलॉजिकल विकारों में बीबीबी व्यवधान को मॉडल करने के लिए किया गया है। इस तरह के आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी का उपयोग रक्त-सीएसएफ बैरियर और बीबीबी के व्यवधान पर नेसेरिया मेनिंगिटिडिस या ग्रुप बी स्ट्रेप्टोकोकस जैसे बैक्टीरियल संक्रमण के प्रभावों की जांच करने के लिए भी किया गयाहै। इसके अलावा, सिजोफ्रेनिया के साथ 22q विलोपन सिंड्रोम रोगियों से आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी का उपयोग करते हुए, शोधकर्ताओं ने इंटरसेलुलर आसंजन अणु-1 (आईसीएएम-1) में वृद्धि देखी, जो बीएमईसी में एक प्रमुख आसंजन अणु है जो मस्तिष्क४३में ल्यूकोसाइट्स की भर्ती और अतिव्यवसंकरण के साथ सहायता करता है । एक साथ लिया, इन अध्ययनों जटिल न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारों में BBB व्यवधान का अध्ययन करने के लिए आईपीएससी-व्युत्पन्न BMECs की उपयोगिता का प्रदर्शन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
संशोधन और समस्या निवारण
इस प्रोटोकॉल में, हमने बीएमईसी(चित्रा 1)के व्युत्पन्न के लिए आईपीएससी संस्कृति के दौरान आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले एक्सपेरिमेंटल मैट्रिक्स और से?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को अभिनव नए वैज्ञानिकों (दिमाग) पुरस्कार R01MH113858 (आरके को), एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य पुरस्कार KL2 TR0002542 (PL) के लिए एक राष्ट्रीय मानसिक स्वास्थ्य जैव व्यवहार अनुसंधान पुरस्कार के एक राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था । एक राष्ट्रीय मानसिक स्वास्थ्य नैदानिक वैज्ञानिक विकास पुरस्कार K08MH086846 (आरके के लिए), एक सिडनी आर Baer जूनियर फाउंडेशन अनुदान (पी एल) डोरिस ड्यूक चैरिटेबल फाउंडेशन नैदानिक वैज्ञानिक विकास पुरस्कार (आरके के लिए), रयान Licht गाया द्विध्रुवी फाउंडेशन (आरके के लिए), फिलिस & जेरोम Lyle Rappaport फाउंडेशन (आरके के लिए), हार्वर्ड स्टेम सेल संस्थान (आरके के लिए) और स्टीव Willis और एलिसा फ्रायड (आरके के लिए) द्वारा । हम डॉ एनी कथूरिया को पांडुलिपि पर उनके महत्वपूर्ण पठन और प्रतिक्रिया के लिए धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| Accutase | Sigma Aldrich | A6964-100mL | |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A-31572 | |
| B27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb | Cell Signaling | 3528S | |
| CLDN5 (Claudin-5) | Thermo Fisher Scientific | 35-2500 | |
| Collagen IV from human placenta | Sigma Aldrich | C5533-5mg | |
| Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 8670 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) | Corning | 353046 | |
| Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) | Corning | 353047 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) | Corning | 3460 | |
| Countess slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| DMEM/F12 (without phenol red) | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-50mL | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663-10ML | |
| DPBS (+/+) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 14040-117 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 | World Precision Instruments | N/A | |
| Essential 6 Medium (Thermo Fisher) | Thermo Fisher Scientific | A1516401 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2006-2mg | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium | Thermo Fisher Scientific | 24020-117 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human endothelial serum-free medium | Thermo Fisher Scientific | 11111044 | |
| InCell Analyzer 6000 | General Electric | N/A | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| MK-571 | Sigma Aldrich | M7571-5MG | |
| NutriStem | Stemgent | 01-0005 | |
| Occludin | Thermo Fisher Scientific | 33-1500 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
| Recombinant Human VEGF 165 | Peprotech | 100-20 | |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625-100MG | |
| Rhodamine 123 | Sigma Aldrich | 83702-10MG | |
| SLC2A1 (GLUT-1) | ThermoFisher | PA1-21041 | |
| SOX17 | Cell Signaling | 81778S | |
| TJP-1 (ZO-1) | ThermoFisher | PA5-28869 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) | Sigma Aldrich | SML0572-5MG | |
| Versene solution | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Tocris/Thermo Fisher Scientific | 1254 |
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