Dérivation, expansion, cryopréservation et caractérisation des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme
Summary
Ce protocole détaille une méthode adaptée pour dériver, étendre, et cryopréserver des cellules endothéliales microvasculaires de cerveau obtenues en différeciant les cellules souches pluripotentes induites par l’homme, et pour étudier des propriétés de barrière de cerveau de sang dans un modèle ex vivo.
Abstract
Les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau (BMECs) peuvent être différenciées des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (IPSC) pour développer des modèles cellulaires ex vivo pour étudier la fonction de barrière céphalo-encéphalique (BBB). Ce protocole modifié fournit des étapes détaillées pour tirer, étendre et cryopréserver les CPE des IPSC humains à l’aide d’un donneur et d’un reagents différents de ceux rapportés dans les protocoles précédents. Les iPSC sont traités avec le milieu essentiel de 6 pendant 4 jours, suivis de 2 jours de milieu humain endothélial de culture sérum-libre complété avec le facteur de croissance fibroblaste de base, l’acide rétinoïque, et le supplément de B27. Au jour 6, les cellules sont sous-cultivés sur une matrice collagène/fibronectine pendant 2 jours. L’immunocytochimie est effectuée au jour 8 pour l’analyse des marqueurs BMEC à l’aide de CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 et SLC2A1. Le ballonnement occidental est exécuté pour confirmer l’expression de marqueur de BMEC, et l’absence de SOX17, un marqueur endodermal. Le potentiel angiogénique est démontré avec un essai de germination. La résistance électrique trans-endothéliale (TEER) est mesurée à l’aide d’électrodes baguettes et de voltohmmètres à partir du jour 7. L’activité transporteur Efflux pour la sous-famille de cassettes de liaison ATP B membre 1 et la sous-famille de cassettes de liaison ATP C membre 1 est mesurée à l’aide d’un lecteur multi-plaques au jour 8. La dérivation réussie des BMEC est confirmée par la présence de marqueurs cellulaires pertinents, de faibles niveaux de SOX17, de potentiel angiogénique, d’activité de transporteur et de valeurs TEER ~2000 Ω x cm2. Les BMEC sont élargis jusqu’au jour 10 avant de passer sur des plaques de collagène/fibronectine fraîchement enrobées ou cryopréservées. Ce protocole démontre que les BMEC dérivés de l’iPSC peuvent être élargis et adoptés au moins une fois. Cependant, des valeurs TEER plus faibles et une localisation plus faible des marqueurs BMEC ont été observées après cryopréservation. Les BMEC peuvent être utilisés dans des expériences de co-culture avec d’autres types de cellules (neurones, gliales, péricytes),dans des modèles cérébraux tridimensionnels (puce d’organe et hydrogel), pour la vascularisation des organoïdes cérébraux, et pour étudier le dysfonctionnement de BBB dans les désordres neuropsychiatriques.
Introduction
Fonction barrière céphalo-cérébrale
La barrière céphalo-encéphalique (BBB) forme une limite qui limite le mouvement des substances du sang vers le cerveau. Le BBB est composé de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMECs) qui forment un monocouche tapissant la vascularisation. Les BMEC, ainsi que les astrocytes, les neurones, les péricytes, les microglies et la matrice extracellulaire, forment l’unité neurovasculaire. Les BMEC ont une structure paracellulaire étroitement régulée qui permet au BBB de maintenir une résistance électrique trans-endothéliale élevée (TEER), ce qui limite la diffusion passive et sert d’indicateur del’intégrité de la barrière 1,2. Les BMEC ont également des protéines qui aident au mouvement transcellulaire tel que l’endocytose, la transcytose, et la transmigration, aussi bien que l’extravasation des leucocytes pendant une réponse immunisée3. Les BMEC comptent sur l’afflux et les transporteurs d’efflux pour nourrir et enlever les déchets, afin de maintenir un équilibre homéostatique dans lecerveau 3. Par exemple, solute transporteur famille 2 membre 1 (SLC2A1) est un transporteur d’afflux responsable du mouvement du glucose à travers le BBB4, tandis que les transporteurs efflux tels que la sous-famille de cassettes de liaison ATP B membre 1 (ABCB1) et la sous-famille de cassettes de liaison ATP C membre 1 (ABCC1) sont responsables du retour des substrats dans le fluxsanguin 3,5,6,7. Les substrats ABCB1 comprennent la morphine, le verapamil4et les antipsychotiques tels que l’olanzapine et la rispéridone8,tandis que le transporteur ABCC1 a une variété de substrats, y compris les conjugués de sulfate, la vincristine et les conjugués au glucuronide4.
Application de modèles BBB dans les troubles psychiatriques
Le dysfonctionnement de BBB a été impliqué dans un certain nombre de désordres neurologiques et psychiatriques, y compris la schizophrénie et le désordrebipolaire 9,10. Récemment, des modèles cellulaires ex vivo dérivés de l’iPSC sont utilisés pour interroger les fondements cellulaires et moléculaires des troubles psychiatriques, mais ces modèles ne prennent actuellement pas en compte le rôle potentiel joué par la neurovasculature11,12,13. On émet l’hypothèse que les cytokines inflammatoires périphériques circulant dans le sang peuvent avoir un impact négatif sur le BBB14,15,16,17, mais il ya aussi des preuves pour paracellulaire18,19,20,21,22, transcellulaire23,24,25,26,27,28,29,et la matrice extracellulaire20,29,30,31,32 anomalies contribuant au dysfonctionnement BBB. La perturbation du BBB peut avoir comme conséquence le contenu du sang entrant dans le parenchyme de cerveau et activant des astrocytes et/ou des microglies pour libérer des cytokines proinflammatory, qui à leur tour initient une réponseinflammatoire 33 qui peut avoir des effets préjudiciables surle cerveau 34. Les BMEC sont la composante principale du BBB et l’examen de la structure et de la fonction de ces cellules peut améliorer la compréhension du dysfonctionnement de BBB dans les désordres neurologiques et psychiatriques.
Modèles alternatifs BMEC
Avant l’élaboration de protocoles efficaces pour l’exploitation des BMECs à partir d’iPSC1,6,35,36, les chercheurs avaient utilisé des BMECsimmortalisés 37 pour étudier la fonction BBB. Cependant, beaucoup de ces modèles n’ont pas atteint les phénotypes souhaitables de BBB, une telle gamme physiologique des valeurs de TEER38,39. L’utilisation d’iPSCs a l’avantage de conserver le contexte génétique de l’individu à partir duquel les cellules sont dérivées. Les scientifiques travaillent activement à l’établissement de modèles de microenvironnement ex vivo dérivés de l’iPSC qui récapitulent la structure et la fonction du cerveau humain. Les chercheurs ont mis au point des méthodes pour obtenir des BMEC qui sont structurellement et physiologiquement similaires aux BMECs trouvés in vivo. Les méthodes d’obtention de populations purifiées de BMEC dérivés de l’iPSC nécessitent un certain nombre d’étapes différentes avec des protocoles optimisés au cours desdernières années 1,6,35,36. Généralement, les BMECs iPSC-dérivés sont cultivés dans le milieu essentiel 6 (E6) pendant 4 jours, suivis de 2 jours dans le milieu sans sérum endothélial humain (hESFM) complété avec le facteur de croissance fibroblaste de base (bFGF), l’acide rétinoïque (RA), et le supplément de B27. Les cellules sont ensuite cultivés sur une matrice de collagène IV (COL4) et de fibronectine (FN) pour obtenir >90% homogène BMECs1.
L’identité des BMEC est confirmée par immunofluorescence montrant la co-expression des protéines BMEC, y compris la molécule d’adhérence des cellules plaquettaire-endothéliales-1 (PECAM1), SLC2A1, et les protéines de jonction serrées telles que la protéine de jonction serrée 1 (TJP1), l’occludine (OCLN) et la claudin-5 (CLDN5)6. Des analyses de germination ont été employées pour confirmer le potentiel angiogenic des BMECs iPSC-dérivés. 6 L’intégrité BBB des BMEC est évaluée par la présence de valeurs physiologiques in vitro TEER (~2000Ω x cm2)37 et d’activité mesurable pour les transporteurs d’efflux tels que ABCB1 et ABCC11,6,36. Les progrès méthodologiques récents du groupe Lippmann ont conduit à des protocoles BMEC dérivés de l’iPSC avec une variabilité expérimentale réduite et une reproductibilitéaccrue 1. Cependant, on ne sait pas s’ils peuvent être étendus et transmis au-delà de l’étape de la sous-culture. Notre protocole modifié vise à résoudre ce problème en réussissant les BMEC dérivés de l’iPSC au-delà du jour 8 et en évaluant s’ils peuvent être encore élargis pour conserver les propriétés BBB après cryopréservation. Bien qu’aucune étude n’ait décrit le passage des BMECs iPSC-dérivés, un protocole existe pour la cryopréservation de BMEC qui retient des propriétés physiologiques de BBB après avoir subi un cycle de gel-dégel40. Cependant, il n’est pas connu après la cryopréservation BMECs peuvent être adoptés et conserver les propriétés BBB.
Les BMECs dérivés d’iPSCs utilisant le protocole Lippmann ont été utilisés pour modéliser la perturbation bbb dans les troubles neurologiques tels que la maladie de Huntington7. Ces BMECs iPSC-dérivés ont également été utilisés pour étudier les effets de l’infection bactérienne telle que Neisseria meningitidis ou Streptococcus de groupe B sur la perturbation de la barrière de sang-CSF et BBBrespectivement 41,42. En outre, utilisant des BMECs iPSC-dérivés des patients de syndrome de suppression de 22q présentant la schizophrénie, les chercheurs ont observé une augmentation de molécule d’adhérence intercellulaire-1 (ICAM-1), une molécule importante d’adhérence dans les BMECs qui aident au recrutement et à l’extravasation des leucocytes dans lecerveau 43. Prises ensemble, ces études démontrent l’utilité des BMECs iPSC-dérivés pour étudier la perturbation de BBB dans les désordres neuropsychiatriques complexes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modifications et dépannage
Dans ce protocole, nous avons apporté quelques modifications à l’utilisation d’une matrice extracellulaire couramment utilisée et de médias de culture cellulaire pendant la culture iPSC pour la dérivation des BMECs (Figure 1). Ces changements n’ont pas eu d’impact sur la capacité de tirer BMECS des iPSCs humains tels que décrits dans le protocole Lippmann1. Une lignée iPSC d’un …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été appuyés par un Prix national de recherche biocomportemental de l’Institut national de santé mentale pour les nouveaux scientifiques innovateurs (BRAINS) Prix R01MH113858 (à R.K.), un National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL). un National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (à R.K.), une subvention de la Sydney R Baer Jr Foundation Grant (à P.L.) le Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (à R.K.), la Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (à R.K.), le Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (à R.K.), le Harvard Stem Cell Institute (à R.K.) et par Steve Willis et Elissa Freud (à R.K.). Nous remercions la Dre Annie Kathuria pour sa lecture critique et ses commentaires sur le manuscrit.
Materials
| 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| Accutase | Sigma Aldrich | A6964-100mL | |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A-31572 | |
| B27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb | Cell Signaling | 3528S | |
| CLDN5 (Claudin-5) | Thermo Fisher Scientific | 35-2500 | |
| Collagen IV from human placenta | Sigma Aldrich | C5533-5mg | |
| Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 8670 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) | Corning | 353046 | |
| Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) | Corning | 353047 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) | Corning | 3460 | |
| Countess slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| DMEM/F12 (without phenol red) | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-50mL | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663-10ML | |
| DPBS (+/+) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 14040-117 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 | World Precision Instruments | N/A | |
| Essential 6 Medium (Thermo Fisher) | Thermo Fisher Scientific | A1516401 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2006-2mg | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium | Thermo Fisher Scientific | 24020-117 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human endothelial serum-free medium | Thermo Fisher Scientific | 11111044 | |
| InCell Analyzer 6000 | General Electric | N/A | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| MK-571 | Sigma Aldrich | M7571-5MG | |
| NutriStem | Stemgent | 01-0005 | |
| Occludin | Thermo Fisher Scientific | 33-1500 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
| Recombinant Human VEGF 165 | Peprotech | 100-20 | |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625-100MG | |
| Rhodamine 123 | Sigma Aldrich | 83702-10MG | |
| SLC2A1 (GLUT-1) | ThermoFisher | PA1-21041 | |
| SOX17 | Cell Signaling | 81778S | |
| TJP-1 (ZO-1) | ThermoFisher | PA5-28869 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) | Sigma Aldrich | SML0572-5MG | |
| Versene solution | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Tocris/Thermo Fisher Scientific | 1254 |
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