JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

اشتقاق، توسعة، المحافظة على التبريد وتوصيف خلايا الدماغ البطانية الدقيقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان

Published: November 19, 2020
doi:
10.3791/61629
, ,
1Center for Genomic Medicine,Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry,Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program,Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry,Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program,McLean Hospital

Summary

هذا البروتوكول تفاصيل طريقة مكيفة لاشتقاق, توسيع, و cryopreserve خلايا البطانية الأوعية الدموية المجهرية التي تم الحصول عليها عن طريق التمييز بين الخلايا الجذعية متعددة القدرات الناجمة عن النشاط البشري, ودراسة خصائص حاجز الدم في الدماغ في نموذج الجسم الحي السابق.

Abstract

يمكن تمييز الخلايا البطاخلية الدقيقة في الدماغ (BMECs) عن الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريًا (iPSCs) لتطوير نماذج خلوية سابقة للدماغ (BBB) لدراسة حاجز الدم في الدماغ. ويوفر هذا البروتوكول المعدل خطوات تفصيلية لاشتقاق وتوسيع وتكرير BMECs من مراكز iPSCs البشرية باستخدام متبرع وكاشفات مختلفة عن تلك التي تم الإبلاغ عنها في البروتوكولات السابقة. يتم التعامل مع iPSCs مع الأساسية 6 المتوسطة لمدة 4 أيام، تليها 2 أيام من endothelial الإنسان خالية من المصل المتوسطة المتوسطة تكملها عامل النمو الليفي الأساسي، حمض الريتينويك، وتكملة B27. في اليوم 6، الخلايا هي تحت-مثقف على مصفوفة الكولاجين/فيبرومينكتين لمدة 2 أيام. يتم إجراء الكيمياء المناعية في اليوم 8 لتحليل علامة BMEC باستخدام CLDN5 و OCLN و TJP1 و PECAM1 و SLC2A1. يتم تنفيذ النشاف الغربي لتأكيد تعبير علامة BMEC ، وغياب SOX17 ، وهي علامة ادمرمة. ويتضح احتمال أنجيوجينيك مع فحص تنبت. يتم قياس المقاومة الكهربائية عبر بطانة الرحم (TEER) باستخدام أقطاب عيدان الطعام ومقياس الفولث بدءاً من اليوم السابع. يتم قياس نشاط النقل Efflux لـ ATP ربط كاسيت subfamily B عضو 1 ATP ربط كاسيت subfamily عضو C 1 باستخدام قارئ لوحة متعددة في اليوم 8. ويؤكد الاشتقاق الناجح لـ BMECs وجود علامات الخلية ذات الصلة، وانخفاض مستويات SOX17، وإمكانية التشغية، ونشاط الناقل، وقيم TEER ~ 2000 Ω × سم2. يتم توسيع BMECs حتى اليوم 10 قبل تمرير على لوحات الكولاجين المطلية حديثا / فيبرومينكين أو cryopreserved. يوضح هذا البروتوكول أنه يمكن توسيع BMECs المشتقة من iPSC و تمريرها مرة واحدة على الأقل. ومع ذلك، فقد لوحظت قيم أقل من TEER وتعريب أقل لعلامات BMEC بعد الحفظ بالتبريد. يمكن استخدام BMECs في تجارب الثقافة المشتركة مع أنواع الخلايا الأخرى (الخلايا العصبية ، glia ، pericytes)، في نماذج الدماغ ثلاثية الأبعاد (رقاقة الجهاز والهيدروجيل) ، لإضفاء الطابع الوعائي على الأعضاء في الدماغ ، ولدراسة الخلل في خلل BBB في الاضطرابات النفسية العصبية.

Introduction

وظيفة حاجز الدم في الدماغ
يشكل حاجز الدم في الدماغ (BBB) حدًا يحد من حركة المواد من الدم إلى الدماغ. وBBB يتكون من خلايا البطاخلية الدقيقة في الدماغ (BMECs) التي تشكل أحادية الطبقة بطانة الأوعية الدموية. BMECs، جنبا إلى جنب مع الخلايا الفلكية، والخلايا العصبية، وال بيريكيتس، microglia، ومصفوفة خارج الخلية، تشكل وحدة الأوعية العصبية. BMECs لديها هيكل شبه الخلايا المنظمة بإحكام يسمح BBB للحفاظ على مقاومة كهربائية عالية عبر ال endothelial (TEER) ، مما يحد من الانتشار السلبي ويعمل كمؤشر على سلامة الحاجز1،2. BMECs أيضا البروتينات التي تساعد في الحركة عبر الخلية مثل الاندوس، transcytosis، والهجرة، فضلا عن البذخ من الكريات البيض خلال استجابة مناعية3. تعتمد BMECs على تدفق و efflux الناقلين للتغذية وإزالة النفايات المنتجات، من أجل الحفاظ على التوازن المثلي في الدماغ3. على سبيل المثال، المنقول الناقل الأسرة 2 عضو 1 (SLC2A1) هو ناقل تدفق المسؤولة عن حركة الجلوكوز عبر BBB4، في حين أن الناقلين efflux مثل ATP ربط الكاسيت B عضو 1 (ABCB1) و ATP ربط الكاسيت الفرعي C عضو 1 (ABCC1) هي المسؤولة عن العودة الركائز مرة أخرى إلى مجرى الدم3،5،6،7. ABCB1 ركائز تشمل المورفين, فيراباميل4, ومضادات الذهان مثل olanzapine وrisperidone8, في حين أن الناقل ABCC1 لديه مجموعة متنوعة من ركائز بما في ذلك المتقارنات كبريتات, vincristine, وglucuronide conjugates4.

تطبيق نماذج BBB في الاضطرابات النفسية
وقد تورط الخلل BBB في عدد من الاضطرابات العصبية والنفسية, بما في ذلك الفصام والاضطراب ثنائي القطب9,10. في الآونة الأخيرة ، iPSC المستمدة من النماذج الخلوية السابقة vivo تستخدم لاستجواب الأسس الخلوية والجزيئية من الاضطرابات النفسية ، ولكن هذه النماذج حاليا لا تأخذ في الاعتبار الدور المحتمل الذي تضطلع به neurovasculature11،12،13. هو افتراض أن السيتوكينات الالتهابية الطرفية المتداولة في الدم يمكن أن تؤثر سلبا على BBB14،15،16،17، ولكن هناك أيضا أدلة على18شبه الخلية،19،20،21،2122,عبر الخلية23,24,25,26,27,28,29, ومصفوفة خارج الخلية20,29,30,31,32 تشوهات تساهم في خلل BBB. يمكن أن يؤدي تعطيل BBB إلى دخول محتويات الدم إلى الدماغ وproenchyma وتفعيل الخلايا الفلكية و /أو microglia لإطلاق السيتوكينات البروينفلورية ، والتي بدورها تبدأ استجابة التهابية33 التي يمكن أن يكون لها آثار ضارة على الدماغ34. BMECs هي المكون الرئيسي لBBB ودراسة هيكل ووظيفة هذه الخلايا يمكن أن تعزز فهم الخلل BBB في الاضطرابات العصبية والنفسية.

نماذج BMEC البديلة
قبل تطوير بروتوكولات فعالة لاشتقاق BMECs من iPSCs1,6,35,36, كان الباحثون قد استخدموا BMECs37 الخالدة لدراسة وظيفة BBB. ومع ذلك، فشل العديد من هذه النماذج لتحقيق المرغوب فيه BBB الظاهريات، مثل هذا النطاق الفسيولوجية من القيم38،39. 2- والاستفادة من مراكز الـ iPSCs هي ميزة الاحتفاظ بالخلفية الوراثية للفرد الذي تُستمد منه الخلايا. يعمل العلماء بنشاط على إنشاء نماذج البيئة الدقيقة المستمدة من iPSC التي تُخص بنية ووظيفة الدماغ البشري. وقد طور الباحثون أساليب لاشتقاق BMECs التي تشبه هيكليا وفسيولوجيا BMECs الموجودة في الجسم الحي. تتطلب طرق الحصول على مجموعات منقّاة من BMECs المشتقة من iPSC عددًا من الخطوات المختلفة مع بروتوكولات يتم تحسينها في السنوات القليلة الماضية1و6و35و36. عموما, iPSC المشتقة من BMECs هي مثقف في الأساسية 6 (E6) المتوسطة لمدة 4 أيام, تليها 2 أيام في الإنسان endothelial المصل خالية من المتوسطة (hESFM) تكمل مع عامل النمو الليفي الأساسي (bFGF), حمض الريتينيك (RA), و B27 الملحق. ثم يتم استزراع الخلايا على الكولاجين الرابع (COL4) ومصفوفة فيبرومينيكتان (FN) للحصول على > 90٪ BMECs متجانسة1.

يتم تأكيد هوية BMECs عن طريق الفلوروس المغناطيسية التي تظهر التعبير المشترك لبروتينات BMEC بما في ذلك جزيء التصاق الخلايا البطانية الصفائح الدموية -1 (PECAM1) وSLC2A1 والبروتينات الضيقة مثل وصلة الوصل الضيقة البروتين 1 (TJP1) ، occludin (OCLN) ، وكلاودن -5 (CLDN5)6. وقد استخدمت مقايسات النتـر للتأكد من الإمكانات الـ أوعية للـ iPSC المشتقة من BMECs. 6 يتم تقييم سلامة BBB من BMECs من خلال وجود قيم فيزيولوجية في المختبر TEER (~20000Ω × سم2)37 ونشاط قابل للقياس لنقل efflux مثل ABCB1 وBCC11،6،36. وقد أدت التطورات المنهجية الأخيرة من قبل مجموعة ليبمان إلى بروتوكولات BMEC المشتقة من iPSC مع تقليل التغير التجريبي وتعزيز قابلية التكاثر1. ومع ذلك، لا يُعرف ما إذا كان من الممكن توسيعها وتجاوزها إلى ما بعد مرحلة الاستزراع الفرعي. يهدف بروتوكولنا المعدل إلى معالجة هذه المشكلة عن طريق تمرير BMECs المشتقة من iPSC إلى ما بعد اليوم الثامن وتقييم ما إذا كان يمكن توسيعها بشكل أكبر للاحتفاظ بخصائص BBB بعد الحفظ بالتبريد. في حين لم تصف أي دراسات تمرير BMECs المشتقة من iPSC ، يوجد بروتوكول للحفظ بالتبريد BMEC الذي يحتفظ بخصائص BBB الفسيولوجية بعد خضوعه لدورة التجميد40. ومع ذلك، فإنه غير معروف BMECs ما بعد التبريد يمكن أن يكون ممر والاحتفاظ بخصائص BBB.

BMECs المستمدة من iPSCs باستخدام بروتوكول ليبمان وقد استخدمت لنموذج اضطراب BBB في الاضطرابات العصبية مثل مرض هنتنغتون7. وقد استخدمت هذه BMECs مشتقة من iPSC أيضا للتحقيق في آثار العدوى البكتيرية مثل التهاب السحايا Neisseria أو المجموعة B العقدية على تعطيل حاجز CSF الدم وBBB على التوالي41,42. أيضا، باستخدام BMECs المشتقة من iPSC من مرضى متلازمة الحذف 22q الذين يعانون من الفصام، لاحظ الباحثون زيادة في جزيء التصاق بين الخلايا-1 (ICAM-1)، وهو جزيء التصاق كبير في BMECs التي تساعد في التوظيف والبذخ من الكريات البيض في الدماغ43. هذه الدراسات مجتمعة، تثبت فائدة BMECs المشتقة من iPSC لدراسة اضطراب BBB في الاضطرابات العصبية والنفسية المعقدة.

Protocol

تمت إعادة برمجة iPSCs الإنسان من الخلايا الليفية من المتبرعين الأصحاء باستخدام بروتوكول وافق عليه المجلسين مراجعة المؤسسات من مستشفى ماساتشوستس العام ومستشفى ماكلين, وتتميز كما وصف في الدراسات السابقة44,45,46. ملاحظة: باختصار?…

Representative Results

تمايز BMECوينبغي اتباع بعض الخطوات الهامة في هذا البروتوكول بدقة(الشكل 1). E6 متوسطة الاستخدام في اليوم 1 مهم، لأنه غالبا ما يستخدم لاشتقاق نسب العصبية من iPSCs خلال فترة قصيرة نسبيا من الزمن تسفر عن نتائج استنساخ عبر خطوط الخلايا المتعددة36. وثمة خطوة هام?…

Discussion

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

في هذا البروتوكول، قمنا بإجراء بعض التعديلات في استخدام مصفوفة خارج الخلية شائعة الاستخدام والخلايا وسائل الإعلام ثقافة خلال زراعة iPSC لاشتقاق BMECs(الشكل 1). لم تؤثر هذه التغييرات على القدرة على اشتقاق BMECS من iPSCs ا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة العقلية جوائز البحوث السلوكية البيولوجية للعلماء الجدد المبتكرين (BRAINS) جائزة R01MH113858 (إلى R.K.) ، وهي المعاهد الوطنية للصحة جائزة KL2 TR002542 (PL). A المعهد الوطني للصحة العقلية جائزة تطوير العلماء السريرية K08MH086846 (لR.K.) ، وسيدني R Baer الابن منحة مؤسسة (ل. ل) دوريس الخيرية جائزة تطوير العلماء السريرية (لR.K.) ، وريان ليخت سانج ثنائية القطب مؤسسة (إلى R.K.) ، وفيليس & مؤسسة جيروم لايل رابابورت (إلى R.K.)، ومعهد هارفارد للخلايا الجذعية (إلى R.K.) وستيف ويليس وإليسا فرويد (إلى R.K.). نشكر الدكتورة آني كاثروريا على قراءتها النقدية وردود الفعل على المخطوطة.

Materials

2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
Accutase Sigma Aldrich A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A-31572
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb Cell Signaling 3528S
CLDN5 (Claudin-5) Thermo Fisher Scientific 35-2500
Collagen IV from human placenta Sigma Aldrich C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial  Corning  8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) Corning 353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) Corning 353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) Corning 3460
Countess slides Thermo Fisher Scientific C10228
DMEM/F12 (without phenol red) Thermo Fisher Scientific  A1413202
DMSO Sigma Aldrich D2438-50mL
Donkey serum Sigma Aldrich D9663-10ML
DPBS (+/+) Gibco/Thermo Fisher Scientific 14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 World Precision Instruments N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F2442
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium  Thermo Fisher Scientific 24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Human endothelial serum-free medium Thermo Fisher Scientific 11111044
InCell Analyzer 6000 General Electric N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific N/A
MK-571 Sigma Aldrich M7571-5MG
NutriStem Stemgent 01-0005
Occludin Thermo Fisher Scientific 33-1500
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Services 15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader Perkin Elmer N/A
Recombinant Human VEGF 165 Peprotech 100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625-100MG
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1) ThermoFisher PA1-21041
SOX17 Cell Signaling 81778S
TJP-1 (ZO-1) ThermoFisher PA5-28869
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) Sigma Aldrich SML0572-5MG
Versene solution Thermo Fisher Scientific 15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Tocris/Thermo Fisher Scientific 1254
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
  2. Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
  3. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  4. Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
  5. Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to “Open” the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
  6. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
  7. Lim, R. G., et al. Huntington’s Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
  8. Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
  9. Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83 (2017).
  10. Pollak, T. A., et al. The blood-brain barrier in psychosis. Lancet Psychiatry. 5, 79-92 (2018).
  11. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  12. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
  13. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
  14. Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321 (2013).
  15. Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
  16. Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
  17. Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964 (2008).
  18. Greene, C., Hanley, N., Campbell, M. Claudin-5: gatekeeper of neurological function. Fluids and Barriers of the CNS. 16, 3 (2019).
  19. Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
  20. Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia – connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
  21. Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
  22. Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15 (2014).
  23. Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
  24. Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
  25. de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
  26. Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
  27. Kimchi-Sarfaty, C., et al. A “Silent” Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  28. Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879 (2019).
  29. Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
  30. Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
  31. Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
  32. Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
  33. Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
  34. Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
  35. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2015).
  36. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9 (2017).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Barichello, T. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
  38. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  39. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33 (2013).
  40. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
  41. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181 (2019).
  42. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398 (2017).
  43. Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
  44. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321 (2019).
  45. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
  46. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34 (2020).
  47. Warren, L., Lin, C. mRNA-Based Genetic Reprogramming. Molecular Therapy. 27, 729-734 (2019).
  48. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099 (2014).
  49. Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
  50. Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
  51. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  52. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. NeuroReport. 29, 588-593 (2018).
  53. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  54. Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
  55. Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia – comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
  56. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13 (2015).

Tags

Keywords: Brain Microvascular Endothelial CellsHuman Induced Pluripotent Stem CellsBlood-brain BarrierBMEC DerivationBMEC ExpansionBMEC CryopreservationBMEC CharacterizationTEER AnalysisEfflux Transporter ActivityDisease Modeling
check_url/61629?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (165), e61629, doi:10.3791/61629 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image