JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

İnsan İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Mikrovasküler Endotel Hücrelerinin Derivasyonu, Genişlemesi, Kriyoprezervasyonu ve Karakterizasyonu

Published: November 19, 2020
doi:
10.3791/61629
, ,
1Center for Genomic Medicine,Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry,Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program,Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry,Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program,McLean Hospital

Summary

Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin ayırt edilmesiyle elde edilen beyin mikrovasküler endotel hücrelerini türetmek, genişletmek ve kriyoprezerserve etmek ve bir ex vivo modelde kan beyin bariyeri özelliklerini incelemek için uyarlanmış bir yöntemi detaylandırmaktadır.

Abstract

Beyin mikrovasküler endotel hücreleri (VPC’ler), kan-beyin bariyeri (BBB) fonksiyonunu incelemek için ex vivo hücresel modeller geliştirmek için insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC’ ler) ayırt edilebilir. Bu değiştirilmiş protokol, önceki protokollerde bildirilenlerden farklı bir donör ve reaktif kullanarak insan iPSC’lerinden BMEC’leri türetmek, genişletmek ve kriyoprezerk için ayrıntılı adımlar sağlar. iPSC’ler 4 gün boyunca esansiyel 6 ortam ile tedavi edilir, ardından temel fibroblast büyüme faktörü, retinoik asit ve B27 takviyesi ile desteklenmiş 2 günlük insan endotel serumsuz kültür ortamı ile tedavi edilir. 6. günde, hücreler 2 gün boyunca bir kollajen / fibronektin matrisi üzerine alt kültürlenir. İmmünostokimya, CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 ve SLC2A1 kullanılarak BMEC belirteç analizi için 8. Batı blotting, BMEC işaretleyici ifadesini ve endodermal bir işaretleyici olan SOX17’nin yokluğunu onaylamak için gerçekleştirilir. Anjiyojenik potansiyel filizlenen bir test ile gösterilmiştir. Trans-endotel elektrik direnci (TEER), 7. günden itibaren çubuk elektrotlar ve voltohmmetre kullanılarak ölçülür. ATP bağlama kaseti alt familyası B üye 1 ve ATP bağlama kaseti alt familyası C üye 1 için efflux taşıyıcı etkinliği 8. günde çok plakalı okuyucu kullanılarak ölçülür. BMEC’lerin başarılı türemesi, ilgili hücre belirteçlerinin varlığı, düşük SOX17 seviyeleri, anjiyojenik potansiyel, taşıyıcı aktivitesi ve TEER değerlerinin ~2000 Ω x cm2varlığı ile doğrulanır. BMEC’ler, taze kaplanmış kollajen/ fibronektin plakalarına geçmeden veya kriyoprezserved olmadan önce 10 güne kadar genişletilir. Bu protokol, iPSC türevli BMEC’lerin en az bir kez genişletilebileceğini ve geçebileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, kriyoprezervasyondan sonra daha düşük TEER değerleri ve BMEC işaretleyicilerinin daha zayıf lokalizasyonu gözlenmiştir. BMEC’ler diğer hücre tipleriyle (nöronlar, glialar, perisitler) ortak kültürdeneylerinde, üç boyutlu beyin modellerinde (organ çipi ve hidrojel), beyin organoidlerinin damarlanması ve nöropsikiyatrik bozukluklarda BBB disfonksiyonunun incelenmesi için kullanılabilir.

Introduction

Kan-Beyin Bariyer fonksiyonu
Kan-beyin bariyeri (BBB), maddelerin kandan beyne hareketini sınırlayan bir sınır oluşturur. BBB, vaskülat astarlı bir monolayer oluşturan beyin mikrovasküler endotel hücrelerinden (VPC’ ler) oluşur. BMEC’ler, astrositler, nöronlar, perisitler, mikroglia ve hücre dışı matris ile birlikte nörovasküler üniteyi oluşturur. BMEC’ler, BBB’nin pasif difüzyonu sınırlayan ve bariyer bütünlüğünün bir göstergesi olarak hizmet eden yüksek trans-endotel elektrik direncini (TEER) korumasını sağlayan sıkı bir şekilde düzenlenmiş parasellüler yapıya sahiptir1,2. BMEC’ler ayrıca endositoz, transsitoz ve transmigrasyon gibi hücrelerarası hareketin yanı sıra immün yanıt sırasında lökositlerin ekstravazasyonuna yardımcı olan proteinlere sahiptir3. BMEC’ler, beyinde homeostatik bir dengeyi korumak için atık ürünlerin beslenmesi ve uzaklaştırılması için akın ve efflux taşıyıcılarınagüvenir 3. Örneğin, solute taşıyıcı ailesi 2 üye 1 (SLC2A1), Glikozun BBB4boyunca hareketinden sorumlu bir akın taşıyıcısıdır, ATP bağlama kaseti alt ailesi gibi efflux taşıyıcıları ise B üye 1 (ABCB1) ve ATP bağlama kaseti alt familyası C üye 1 (ABCC1), substratları kan akışına geri döndürmekten sorumludur3,5,6,7. ABCB1 substratları morfin, verapamil4ve olanzapine ve risperidone8gibi antipsikotikleri içerirken, ABCC1 taşıyıcısı sülfat konjugeleri, vincristine ve glucuronide konjugeleri4dahil olmak üzere çeşitli substratlara sahiptir.

Psikiyatrik Bozukluklarda BBB Modellerinin Uygulanması
BBB disfonksiyonu, şizofreni ve bipolar bozukluk9,10dahil olmak üzere bir dizi nörolojik ve psikiyatrik rahatsızlığa karışmıştır. Son zamanlarda, psikiyatrik bozuklukların hücresel ve moleküler temellerini sorgulamak için iPSC türevli ex vivo hücresel modeller kullanılmaktadır, ancak bu modeller şu anda nörovasküler11 , 12,13tarafından oynanan potansiyel rolü dikkate almamaktadır. Kanda dolaşan periferik inflamatuar sitokinlerin BBB14 , 15,16,17‘yi olumsuz yönde etkileyebileceği varsayılmaktadır, ancak paraselüler18 , 19,20,21,21için de kanıtlarvardır.22, hücreler arası23,24,25,26,27,28,29ve hücre dışı matris20,29,30,31,BBB disfonksiyona katkıda bulunan32 anormallik. BBB’nin bozulması, kanın içeriğinin beyin parenkimine girmesine ve proinflamatuar sitokinleri serbest bırakmak için astrositleri ve / veya mikrogliayı aktive etmesine neden olabilir, bu da beyin üzerinde zararlı etkileri olabilecek enflamatuar bir yanıt33 başlatır34. BMEC’ler BBB’nin birincil bileşenidir ve bu hücrelerin yapısının ve işlevinin incelenmesi nörolojik ve psikiyatrik bozukluklarda BBB disfonksiyonunun anlaşılmasını artırabilir.

Alternatif BMEC Modelleri
IPSC 1 , 6 , 35,36’danBMEC’leri türetmek için etkili protokollerin geliştirilmesindenönce,araştırmacılar BBB işlevini incelemek için ölümsüzleştirilmiş BMEC37’yi çalıştırmışlardı. Bununla birlikte, bu modellerin çoğu istenen BBB fenotiplerine ulaşamadı, böyle bir fizyolojik TEER değerleri aralığı38,39. IPSC’lerin kullanılması, hücrelerin türetildiği bireyin genetik arka planını koruma avantajına sahiptir. Bilim adamları, insan beyninin yapısını ve işlevini yeniden sağlayan iPSC türevi ex vivo mikroçevronment modelleri oluşturmak için aktif olarak çalışıyorlar. Araştırmacılar, yapısal ve fizyolojik olarak in vivo bulunan BMEC’lere benzeyen BMEC’leri türetmek için yöntemler geliştirmiştir. iPSC türevi BMEC’lerin saflaştırılmış popülasyonlarını elde etmek için yöntemler, son birkaç yılda optimize edilen protokollerle bir dizi farklı adım gerektirir1,6,35,36. Genellikle, iPSC türevi BMEC’ler Essential 6 (E6) ortamında 4 gün boyunca kültürlenir, ardından temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), retinoik asit (RA) ve B27 takviyesi ile desteklenmiş insan endotel serumsuz ortamında (hESFM) 2 gün kültürlenir. Hücreler daha sonra bir kollajen IV (COL4) ve fibronektin (FN) matrisi üzerinde kültürlenir ve >% 90 homojen BMEC1elde edilir.

VPC’lerin kimliği, trombosit-endotel hücre yapışma molekülü-1 (PECAM1), SLC2A1 ve sıkı kavşak proteini 1 (TJP1), occludin (OCLN) ve claudin-5 (CLDN5)6gibi sıkı kavşak proteinleri de dahil olmak üzere BMEC proteinlerinin birlikte ekspresyonunu gösteren immünoresans ile doğrulanır. Filizlenen tahliller, iPSC türevli VPC’lerin anjiyojenik potansiyelini doğrulamak için kullanılmıştır. 6 BMEC’lerin BBB bütünlüğü, fizyolojik in vitro TEER değerlerinin (~2000Ω x cm2)37 varlığı ve ABCB1 ve ABCC11,6,36gibi efflux taşıyıcıları için ölçülebilir aktivite ile değerlendirilir. Lippmann grubunun son metodolojik gelişmeleri, deneysel değişkenliği azaltılmış ve tekrarlanabilirliği artırılmış iPSC türevi BMEC protokollerine yol açmıştır1. Bununla birlikte, alt kültleme aşamasının ötesine genişletilip geçilemeyecekleri bilinmemektedir. Değiştirilmiş protokolümüz, iPSC türevi BMEC’leri 8. Hiçbir çalışma iPSC türevi BMEC’lerin geçtiğini açıklamamakla birlikte, bmec kriyoprezervasyonu için donma-çözülme döngüsünden geçtikten sonra fizyolojik BBB özelliklerini koruyan bir protokolvardır 40. Bununla birlikte, kriyoprezervasyon sonrası BMEC’lerin geçebileceği ve BBB özelliklerini koruyabileceği bilinmemektedir.

Lippmann protokolünü kullanan iPSC’lerden türetilen BMEC’ler Huntington hastalığı7gibi nörolojik bozukluklarda BBB bozulmasını modellemek için kullanılmıştır. Bu tür iPSC türevli BMEC’ler, Neisseria meningitidis veya B Grubu Streptococcus gibi bakteriyel enfeksiyonun kan-CSF bariyerinin ve BBB’nin bozulması üzerindeki etkilerini araştırmak için dekullanılmıştır. Ayrıca, şizofrenili 22q delesyon sendromu hastalarından iPSC türevi BMEC’ler kullanan araştırmacılar, LÖK’lerde lökositlerin beyne alınmasına ve ekstravazasyonuna yardımcı olan önemli bir yapışma molekülü olan hücreler arası yapışma molekülü-1’de (ICAM-1) bir artış gözlemlediler43. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar karmaşık nöropsikiyatrik bozukluklarda BBB bozulmasını incelemek için iPSC türevi BMEC’lerin yararını göstermektedir.

Protocol

İnsan iPSC’leri, Massachusetts Genel Hastanesi ve McLean Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulları tarafından onaylanan bir protokol kullanılarak sağlıklı donörlerin fibroblastlarından yeniden programlandı ve önceki çalışmalarda açıklandığı gibi karakterize edildi44,45,46. NOT: Kısaca, fibroblastlar mRNA tabanlı genetik yeniden programlama ile iPSC’ye yeniden programlandı<sup class=…

Representative Results

BMEC FarklılaşmasıBu protokoldeki birkaç kritik adım tam olarak takip edilmelidir (Şekil 1). 1. günde E6 orta kullanımı önemlidir, çünkü genellikle birden fazla hücre hattında tekrarlanabilir sonuçlar veren nispeten kısa bir süre içinde iPSC’lerden nöroektoderm soyu türetmek için kullanılır36. Bir diğer önemli adım, E6 ortamının seyreltilmiş (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF ve 10 μM RA ile iPSC türevi BMEC’leri genişletm…

Discussion

Değişiklikler ve Sorun Giderme

Bu protokolde, BMEC’lerin türetimi için iPSC kültürü sırasında yaygın olarak kullanılan hücre dışı matris ve hücre kültürü medyasının kullanılmasında bazı değişiklikler yaptık (Şekil 1). Bu değişiklikler, Lippmann protokolünde açıklandığı gibi bmecs’i insan iPSC’lerinden türetme yeteneğini etkilemedi1. Bu değiştirilmiş protokolün diğer satırlarla ön…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü KL2 TR002542 (PL) olan Yenilikçi Yeni Bilim İnsanları için Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü Biyobehavioral Araştırma Ödülleri R01MH113858 (R.K.’ye) tarafından desteklendi. Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü Klinik Bilimci Geliştirme Ödülü K08MH086846 (R.K.’ye), Sydney R Baer Jr Vakfı Hibesi (P.L.’ye) Doris Duke Hayır Kurumu Klinik Bilimci Geliştirme Ödülü (R.K.’ye), Ryan Licht Sang Bipolar Vakfı (R.K.’ye), Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Vakfı (R.K.’ye), Harvard Kök Hücre Enstitüsü (R.K.’ye) ve Steve Willis ve Elissa Freud (R.K.’ye). Dr. Annie Kathuria’ya makale hakkındaki eleştirel okumaları ve geri bildirimleri için teşekkür ederiz.

Materials

2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
Accutase Sigma Aldrich A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A-31572
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb Cell Signaling 3528S
CLDN5 (Claudin-5) Thermo Fisher Scientific 35-2500
Collagen IV from human placenta Sigma Aldrich C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial  Corning  8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) Corning 353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) Corning 353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) Corning 3460
Countess slides Thermo Fisher Scientific C10228
DMEM/F12 (without phenol red) Thermo Fisher Scientific  A1413202
DMSO Sigma Aldrich D2438-50mL
Donkey serum Sigma Aldrich D9663-10ML
DPBS (+/+) Gibco/Thermo Fisher Scientific 14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 World Precision Instruments N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F2442
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium  Thermo Fisher Scientific 24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Human endothelial serum-free medium Thermo Fisher Scientific 11111044
InCell Analyzer 6000 General Electric N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific N/A
MK-571 Sigma Aldrich M7571-5MG
NutriStem Stemgent 01-0005
Occludin Thermo Fisher Scientific 33-1500
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Services 15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader Perkin Elmer N/A
Recombinant Human VEGF 165 Peprotech 100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625-100MG
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1) ThermoFisher PA1-21041
SOX17 Cell Signaling 81778S
TJP-1 (ZO-1) ThermoFisher PA5-28869
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) Sigma Aldrich SML0572-5MG
Versene solution Thermo Fisher Scientific 15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Tocris/Thermo Fisher Scientific 1254
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
  2. Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
  3. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  4. Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
  5. Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to “Open” the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
  6. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
  7. Lim, R. G., et al. Huntington’s Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
  8. Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
  9. Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83 (2017).
  10. Pollak, T. A., et al. The blood-brain barrier in psychosis. Lancet Psychiatry. 5, 79-92 (2018).
  11. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  12. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
  13. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
  14. Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321 (2013).
  15. Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
  16. Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
  17. Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964 (2008).
  18. Greene, C., Hanley, N., Campbell, M. Claudin-5: gatekeeper of neurological function. Fluids and Barriers of the CNS. 16, 3 (2019).
  19. Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
  20. Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia – connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
  21. Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
  22. Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15 (2014).
  23. Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
  24. Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
  25. de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
  26. Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
  27. Kimchi-Sarfaty, C., et al. A “Silent” Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  28. Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879 (2019).
  29. Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
  30. Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
  31. Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
  32. Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
  33. Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
  34. Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
  35. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2015).
  36. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9 (2017).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Barichello, T. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
  38. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  39. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33 (2013).
  40. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
  41. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181 (2019).
  42. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398 (2017).
  43. Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
  44. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321 (2019).
  45. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
  46. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34 (2020).
  47. Warren, L., Lin, C. mRNA-Based Genetic Reprogramming. Molecular Therapy. 27, 729-734 (2019).
  48. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099 (2014).
  49. Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
  50. Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
  51. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  52. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. NeuroReport. 29, 588-593 (2018).
  53. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  54. Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
  55. Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia – comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
  56. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13 (2015).

Tags

Keywords: Brain Microvascular Endothelial CellsHuman Induced Pluripotent Stem CellsBlood-brain BarrierBMEC DerivationBMEC ExpansionBMEC CryopreservationBMEC CharacterizationTEER AnalysisEfflux Transporter ActivityDisease Modeling
check_url/61629?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (165), e61629, doi:10.3791/61629 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image