JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

נגזרת, התרחבות, קריומורציה ואפיון של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם

Published: November 19, 2020
doi:
10.3791/61629
, ,
1Center for Genomic Medicine,Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry,Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program,Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry,Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program,McLean Hospital

Summary

פרוטוקול זה מפרט שיטה מותאמת להפקה, הרחבה והקפאה של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח המתקבלים על ידי הבחנה בין תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם, ולחקור תכונות מחסום מוח בדם במודל אקס ויוו.

Abstract

תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMECs) ניתנים להבחנה מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם (iPSCs) כדי לפתח מודלים תאיים אקס ויוו לחקר תפקוד מחסום הדם – מוח (BBB). פרוטוקול זה שהשתנה מספק שלבים מפורטים להפקה, הרחבה והקפאה של בקרי BME מ- IPSCs אנושיים באמצעות תורם ריאגנטים שונים מאלה שדווחו בפרוטוקולים קודמים. iPSCs מטופלים עם חיוני 6 בינוני במשך 4 ימים, ואחריו 2 ימים של מדיום תרבות ללא סרום אנדותל אנושי בתוספת גורם גדילה פיברובלסט בסיסי, חומצה רטינואית, ותוסף B27. ביום 6, תאים הם תת תרבית על מטריצה קולגן / פיברונקטין במשך 2 ימים. אימונוציטוכימיה מבוצעת ביום 8 לניתוח סמן BMEC באמצעות CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 ו- SLC2A1. סופג מערבי מבוצע כדי לאשר ביטוי סמן BMEC, והיעדר SOX17, סמן אנדודרמלי. פוטנציאל אנגיוגני מודגם עם מבחני נבטים. התנגדות חשמלית טרנס-אנדותל (TEER) נמדדת באמצעות אלקטרודות מקלות אכילה ו voltohmmeter החל מהיום 7. פעילות טרנספורטר Efflux עבור קלטת איגוד ATP subfamily B חבר 1 ו ATP כיסוי קלטת subfamily C חבר 1 נמדד באמצעות קורא מרובה לוחות ביום 8. נגזרת מוצלחת של BMECs מאושרת על ידי נוכחות של סמני תא רלוונטיים, רמות נמוכות של SOX17, פוטנציאל אנגיוגני, פעילות טרנספורטר וערכי TEER ~ 2000 Ω x ס”מ2. BMECs מורחבים עד היום 10 לפני המעבר על לוחות קולגן / פיברונקטין מצופים טריים או cryopreserved. פרוטוקול זה מדגים שניתן להרחיב ולעבור בין בקרי BME הנגזרים מ- iPSC לפחות פעם אחת. עם זאת, ערכי TEER נמוכים יותר ולוקליזציה ירודה יותר של סמני BMEC נצפו לאחר ההקפאה. BMECs יכול להיות מנוצל בניסויים תרבית משותפת עם סוגי תאים אחרים (נוירונים, גליה, pericytes), במודלים תלת מימדיים במוח (איבר שבב הידרוג’ל), עבור כלי דם של אורגנואידים במוח, ועל לימוד תפקוד לקוי BBB בהפרעות נוירופסיכיאטריות.

Introduction

תפקוד מחסום הדם – מוח
מחסום הדם – מוח (BBB) יוצר גבול המגביל את תנועת החומרים מהדם למוח. ה- BBB מורכב מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMECs) היוצרים מונולאייה המצפים את כלי הדם. BMECs, יחד עם אסטרוציטים, נוירונים, pericytes, microglia, ומטריצה חוץ תאית, יוצרים את היחידה neurovascular. BMECs יש מבנה paracellular מוסדר היטב המאפשר BBB לשמור על התנגדות חשמלית טרנס אנדותל גבוהה (TEER), אשר מגביל דיפוזיה פסיבית ומשמש כאינדיקטור של שלמות מחסום1,2. BMECs יש גם חלבונים המסייעים עם תנועה transcellular כגון אנדוציטוזיס, transcytosis, גלגול, כמו גם פזרנות של לויקוציטים במהלך תגובה חיסונית3. BMECs מסתמכים על מובילי זרם ופלוטות להזנה והסרה של מוצרי פסולת, על מנת לשמור על איזון הומאוסטטי במוח3. לדוגמה, משפחת נשאים מסיסים 2 חבר 1 (SLC2A1) הוא טרנספורטר זרם אחראי על התנועה של גלוקוז על פני BBB4, בעוד מובילי efflux כגון קלטת מחייבת ATP subfamily B חבר 1 (ABCB1) ואת קלטת איגוד ATP subfamily C חבר 1 (ABCC1) אחראים להחזרת מצעים בחזרה לזרם הדם3,5, 6,7. עם המצעים של ABCB1 נמנים מורפיום, וראפמיל4ואנטי-פסיכוטיים כגון אולנזאפין וריספרידון8, ואילו במשגר ABCC1 יש מגוון מצעים, כולל צירופי סולפט, וינקריסטין וגלוקורוניד4.

יישום מודלים BBB בהפרעות פסיכיאטריות
תפקוד לקוי של BBB היה מעורב במספר הפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות, כולל סכיזופרניה והפרעה דוקוטבית 9,10. לאחרונה, מודלים תאיים אקס ויוו שמקורם ב- iPSC מנוצלים כדי לחקור את היסודות התאיים והמולקולריים של הפרעות פסיכיאטריות, אך מודלים אלה אינם לוקחים בחשבון את התפקיד הפוטנציאלי שמילא המוח11,12,13. השערה היא כי ציטוקינים דלקתיים היקפיים במחזור הדם יכולים להשפיע לרעה על BBB14,15,16,17, אבל יש גם ראיות paracellular18,19,20,21,2 2, טרנסצ’לרי23,24,25,26,27,28,29, ומטריצה חוץ תאית20,29,30,31,32 ליקויים התורמים לתפקוד לקוי של BBB. הפרעה של BBB יכול לגרום לתוכן הדם נכנס parenchyma המוח והפעלת אסטרוציטים ו / או microglia לשחרר ציטוקינים proinflammatory, אשר בתורו ליזום תגובה דלקתית33 זה יכול להיות השפעות מזיקות על המוח34. BMECs הם המרכיב העיקרי של BBB ובחינת המבנה והתפקוד של תאים אלה יכול לשפר את ההבנה של תפקוד לקוי BBB בהפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות.

מודלים חלופיים של BMEC
לפני הפיתוח של פרוטוקולים יעילים להפקת BMECs מ IPSCs1,6,35,36, חוקרים השתמשו BMECs מונצח37 ללמוד פונקציה BBB. עם זאת, רבים מהמודלים הללו לא הצליחו להשיג פנוטיפים רצויים של BBB, טווח פיזיולוגי כזה של ערכי TEER38,39. ניצול iPSCs יש את היתרון של שמירה על הרקע הגנטי של הפרט שממנו נגזרים התאים. מדענים עובדים באופן פעיל על הקמת מודלים ex vivo microenvironment שמקורם ב- iPSC, המאכלסים מחדש את המבנה והתפקוד של המוח האנושי. חוקרים פיתחו שיטות להפקת BMECs הדומים מבחינה מבנית ופיזיולוגית ל- BMECs שנמצאו ב vivo. שיטות להשגת אוכלוסיות מטוהרות של BMECs הנגזרים מ- iPSC דורשות מספר שלבים שונים עם אופטימיזציה של פרוטוקולים בשנים האחרונות1,6,35,36. בדרך כלל, BMECs נגזר iPSC מתורבת חיוני 6 (E6) בינוני במשך 4 ימים, ואחריו 2 ימים בינוני ללא סרום אנדותל אנושי (hESFM) בתוספת גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF), חומצה רטינואית (RA), ותוסף B27. לאחר מכן התאים מתרבתים על קולגן IV (COL4) ומטריצת פיברונקטין (FN) כדי להשיג >90% BMECsהומוגניים 1.

זהותם של BMECs מאושרת על ידי immunofluorescence המציג את הביטוי המשותף של חלבוני BMEC כולל מולקולת הידבקות תאי טסיות דם-אנדותל-1 (PECAM1), SLC2A1 וחלבוני צומת הדוקים כגון חלבון צומת הדוק 1 (TJP1), occludin (OCLN) וקלודין-5 (CLDN5)6. מבחנים נבטים שימשו כדי לאשר את הפוטנציאל האנגיוגני של BMECs שמקורם ב- iPSC. 6 שלמות BBB של BMECs מוערכת על ידי נוכחות של ערכי TEER במבחנה פיזיולוגיים (~ 2000Ω x ס”מ2)37 ופעילות מדידה עבור מובילי קולוקס כגון ABCB1 ו- ABCC11,6,36. ההתקדמות המתודולוגית האחרונה של קבוצת ליפמן הובילה לפרוטוקולי BMEC הנגזרים מ- iPSC עם שונות ניסיונית מופחתת ושחזור משופר1. עם זאת, לא ידוע אם ניתן להרחיבם ולעבור מעבר לשלב התת-פולחן. הפרוטוקול שלנו שונה שואפת לטפל בבעיה זו על ידי העברת BMECs נגזר iPSC מעבר ליום 8 ולהעריך אם הם יכולים להיות מורחבים עוד יותר כדי לשמור על נכסי BBB לאחר cryopreservation. אמנם אין מחקרים תיארו פסיעה של BMECs שמקורם ב- iPSC, אך קיים פרוטוקול עבור cryopreservation BMEC ששומר על תכונות BBB פיזיולוגיות לאחר שעבר מחזור הפשרה בהקפאה40. עם זאת, זה לא ידוע לאחר cryopreservation BMECs ניתן להעביר ולשמור על מאפייני BBB.

BMECs נגזר iPSCs באמצעות פרוטוקול ליפמן נוצלו כדי מודל הפרעה BBB בהפרעות נוירולוגיות כגון מחלת הנטינגטון7. BMECs אלה שמקורם ב- iPSC שימשו גם כדי לחקור את ההשפעות של זיהום חיידקי כגון מנינגיטידיס Neisseria או סטרפטוקוקוס קבוצה B על שיבוש מחסום CSF בדם ו- BBB בהתאמה41,42. כמו כן, באמצעות BMECs שמקורם ב- iPSC מתסמונת מחיקה של 22q חולים עם סכיזופרניה, החוקרים הבחינו בעלייה במולקולת הידבקות בין תאית-1 (ICAM-1), מולקולת הידבקות גדולה ב- BMECs המסייעת בגיוס ופזרנות של לויקוציטים למוח43. יחד, מחקרים אלה מדגימים את התועלת של BMECs נגזר iPSC לחקר שיבוש BBB בהפרעות נוירופסיכיאטריות מורכבות.

Protocol

IPSCs אנושיים תכנתו מחדש מן fibroblasts של תורמים בריאים באמצעות פרוטוקול שאושר על ידי הוועדות לבדיקה מוסדית של בית החולים הכללי של מסצ’וסטס ומקלין החולים, ואפיינו כמתואר במחקריםקודמים 44,45,46. הערה: בקצרה, פיברובלסטים תוכנתו מחדש ל-…

Representative Results

בידול BMECיש לבצע במדויק כמה שלבים קריטיים בפרוטוקול זה (איור 1). E6 שימוש בינוני ביום 1 חשוב, שכן הוא משמש לעתים קרובות להפקת שושלת נוירוקטודרם מ iPSCs בתוך פרק זמן קצר יחסית של זמן מניב תוצאות לשחזור על פני שורות תאים מרובים36. צעד חשוב נוסף הוא ביום 4 של בי?…

Discussion

שינויים ופתרון בעיות

בפרוטוקול זה, ביצענו כמה שינויים בשימוש במטריצה חוץ-תאית נפוצה ובמדיה של תרבות תאים במהלך פולחן iPSC להפקת BMECs (איור 1). שינויים אלה לא השפיעו על היכולת להפיק BMECS מ- IPSCs אנושי כמתואר בפרוטוקול ליפמן1. קו iPSC מתורם בריא אחר…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות הנפש Biobehavioral פרסי מחקר למדענים חדשים חדשניים (BRAINS) פרס R01MH113858 (כדי R.K.), המכון הלאומי לבריאות פרס KL2 TR002542 (PL). פרס המכון הלאומי לפיתוח מדענים קליניים של המכון לבריאות הנפש K08MH086846 (ל-R.K.), מענק קרן סידני R בר ג’וניור (לפי.אל) פרס פיתוח המדען הקליני של קרן הצדקה דוריס דיוק (ל-R.K.), קרן ריאן ליכט סאנג דו-קוטבית (ל-R.K.), פיליס & קרן ג’רום לייל רפפורט (ל אר.קיי), מכון תאי הגזע של הרווארד (ל-R.K. ) ועל ידי סטיב ויליס ואליסה פרויד (ל אר.קיי). אנו מודים לד”ר אנני קת’וריה על הקריאה הביקורתית והמשוב על כתב היד.

Materials

2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
Accutase Sigma Aldrich A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A-31572
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb Cell Signaling 3528S
CLDN5 (Claudin-5) Thermo Fisher Scientific 35-2500
Collagen IV from human placenta Sigma Aldrich C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial  Corning  8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) Corning 353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) Corning 353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) Corning 3460
Countess slides Thermo Fisher Scientific C10228
DMEM/F12 (without phenol red) Thermo Fisher Scientific  A1413202
DMSO Sigma Aldrich D2438-50mL
Donkey serum Sigma Aldrich D9663-10ML
DPBS (+/+) Gibco/Thermo Fisher Scientific 14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 World Precision Instruments N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F2442
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium  Thermo Fisher Scientific 24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Human endothelial serum-free medium Thermo Fisher Scientific 11111044
InCell Analyzer 6000 General Electric N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific N/A
MK-571 Sigma Aldrich M7571-5MG
NutriStem Stemgent 01-0005
Occludin Thermo Fisher Scientific 33-1500
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Services 15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader Perkin Elmer N/A
Recombinant Human VEGF 165 Peprotech 100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625-100MG
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1) ThermoFisher PA1-21041
SOX17 Cell Signaling 81778S
TJP-1 (ZO-1) ThermoFisher PA5-28869
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) Sigma Aldrich SML0572-5MG
Versene solution Thermo Fisher Scientific 15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Tocris/Thermo Fisher Scientific 1254
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
  2. Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
  3. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  4. Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
  5. Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to “Open” the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
  6. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
  7. Lim, R. G., et al. Huntington’s Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
  8. Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
  9. Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83 (2017).
  10. Pollak, T. A., et al. The blood-brain barrier in psychosis. Lancet Psychiatry. 5, 79-92 (2018).
  11. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  12. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
  13. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
  14. Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321 (2013).
  15. Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
  16. Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
  17. Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964 (2008).
  18. Greene, C., Hanley, N., Campbell, M. Claudin-5: gatekeeper of neurological function. Fluids and Barriers of the CNS. 16, 3 (2019).
  19. Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
  20. Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia – connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
  21. Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
  22. Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15 (2014).
  23. Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
  24. Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
  25. de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
  26. Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
  27. Kimchi-Sarfaty, C., et al. A “Silent” Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  28. Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879 (2019).
  29. Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
  30. Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
  31. Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
  32. Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
  33. Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
  34. Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
  35. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2015).
  36. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9 (2017).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Barichello, T. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
  38. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  39. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33 (2013).
  40. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
  41. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181 (2019).
  42. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398 (2017).
  43. Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
  44. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321 (2019).
  45. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
  46. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34 (2020).
  47. Warren, L., Lin, C. mRNA-Based Genetic Reprogramming. Molecular Therapy. 27, 729-734 (2019).
  48. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099 (2014).
  49. Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
  50. Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
  51. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  52. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. NeuroReport. 29, 588-593 (2018).
  53. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  54. Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
  55. Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia – comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
  56. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13 (2015).

Tags

Keywords: Brain Microvascular Endothelial CellsHuman Induced Pluripotent Stem CellsBlood-brain BarrierBMEC DerivationBMEC ExpansionBMEC CryopreservationBMEC CharacterizationTEER AnalysisEfflux Transporter ActivityDisease Modeling
check_url/61629?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (165), e61629, doi:10.3791/61629 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image