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Neuroscience

Derivación, expansión, criopreservación y caracterización de células endoteliales microvasculares cerebrales de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Published: November 19, 2020
doi:
10.3791/61629
, ,
1Center for Genomic Medicine,Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry,Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program,Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry,Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program,McLean Hospital

Summary

Este protocolo detalla un método adaptado para derivar, expandir y criopreservar las células endoteliales microvasculares cerebrales obtenidas diferenciando las células madre pluripotentes inducidas por humanos, y para estudiar las propiedades de la barrera hematoencefálica en un modelo ex vivo.

Abstract

Las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMECs) se pueden diferenciar de las células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) para desarrollar modelos celulares ex vivo para estudiar la función de barrera hematoencefálica (BBB). Este protocolo modificado proporciona pasos detallados para derivar, expandir y criopreservar BMECs de iPSCs humanos utilizando un donante y reactivos diferentes a los notificados en protocolos anteriores. Los iPSC se tratan con esencial 6 medios durante 4 días, seguido de 2 días de cultivo endotelial humano libre de suero medio complementado con factor de crecimiento fibroblasto básico, ácido retinoico, y suplemento B27. En el día 6, las células se sub-cultivan en una matriz de colágeno / fibronectina durante 2 días. La inmunocitoquímica se realiza en el día 8 para el análisis de marcadores BMEC utilizando CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 y SLC2A1. La hinchazón occidental se realiza para confirmar la expresión del marcador BMEC y la ausencia de SOX17, un marcador endodérmico. El potencial angiogénico se demuestra con un ensayo que brota. La resistencia eléctrica transdotelial (TEER) se mide utilizando electrodos de palillo y voltohmómetro a partir del día 7. La actividad del transportador Efflux para la subfamilia de casete de enlace ATP miembro B 1 y miembro C del cassette de unión ATP se mide utilizando un lector multiplaque en el día 8. La derivación exitosa de BMECs se confirma mediante la presencia de marcadores celulares relevantes, bajos niveles de SOX17, potencial angiogénico, actividad transportadora y valores TEER ~2000 Ω x cm2. Los BMECs se expanden hasta el día 10 antes de pasar a placas de colágeno/fibronectina recién recubiertas o criopreservadas. Este protocolo demuestra que los BMECs derivados de iPSC se pueden ampliar y pasar al menos una vez. Sin embargo, se observaron valores TEER más bajos y una localización más pobre de los marcadores BMEC después de la criopreservación. BMECs se puede utilizar en experimentos de co-cultivo con otros tipos de células (neuronas, glia, pericitos), en modelos cerebrales tridimensionales (organ-chip e hidrogel), para la vascularización de organoides cerebrales, y para el estudio de la disfunción BBB en trastornos neuropsiquiátricos.

Introduction

Función de barrera hematoencefálica
La barrera hematoencefálica (BBB) forma un límite que limita el movimiento de sustancias desde la sangre hasta el cerebro. El BBB se compone de células endoteliales microvasculares cerebrales (BMECs) que forman una monocapa que recubre la vasculatura. Los BMECs, junto con astrocitos, neuronas, pericitos, microglia y matriz extracelular, forman la unidad neurovascular. Los BMECs tienen una estructura paracelular estrictamente regulada que permite al BBB mantener una alta resistencia eléctrica transdotelial (TEER), que limita la difusión pasiva y sirve como indicador de la integridad de la barrera1,2. Los BMECs también tienen proteínas que ayudan con el movimiento transcelular como la endocitosis, la transcitosis y la transmigración, así como la extravasación de leucocitos durante una respuesta inmune3. Los BMECs dependen de la afluencia y los transportadores de eflujo para la alimentación y eliminación de productos de desecho, con el fin de mantener un equilibrio homeostatico en el cerebro3. Por ejemplo, solute carrier family 2 member 1 (SLC2A1) es un transportador de afluencia responsable del movimiento de glucosa a través del BBB4, mientras que los transportadores de efflux como el miembro B de casete de encuadernación ATP 1 (ABCB1) y el miembro C de la subfamilia de casete de unión ATP 1 (ABCC1) son responsables de devolver los sustratos de vuelta al torrente sanguíneo3,5,6,7. Los sustratos ABCB1 incluyen morfina, verapamil4,y antipsicóticos como olanzapina y risperidona8,mientras que el transportador ABCC1 tiene una variedad de sustratos incluyendo conjugados de sulfato, vincristina, y glucuronida conjuga4.

Aplicación de modelos BBB en trastornos psiquiátricos
La disfunción del BBB se ha implicado en una serie de trastornos neurológicos y psiquiátricos, incluyendo esquizofrenia y trastorno bipolar9,10. Recientemente, los modelos celulares ex vivo derivados de iPSC están siendo utilizados para interrogar los fundamentos celulares y moleculares de los trastornos psiquiátricos, pero estos modelos actualmente no tienen en cuenta el papel potencial desempeñado por la neurovasculatura11,12,13. Se presume que las citoquinas inflamatorias periféricas que circulan en la sangre pueden afectar negativamente al BBB14,15,16,17,pero también hay evidencia para paracelular18,19,20,21,22, transcelular23,24,25,26,27,28,29, y matriz extracelular20,29,30,31,32 anomalías que contribuyen a la disfunción BBB. La interrupción del BBB puede resultar en el contenido de la sangre que entra en el parénquima cerebral y la activación de astrocitos y/o microglia para liberar citoquinas proinflamatorias, que a su vez inician una respuesta inflamatoria33 que puede tener efectos perjudiciales en el cerebro34. Los BMECs son el componente principal del BBB y examinar la estructura y la función de estas células puede mejorar la comprensión de la disfunción del BBB en trastornos neurológicos y psiquiátricos.

Modelos ALTERNATIVOS BMEC
Antes del desarrollo de protocolos eficientes para derivar BMECs de iPSCs1,6,35,36,los investigadores habían empleado BMECsinmortalizados 37 para estudiar la función BBB. Sin embargo, muchos de estos modelos no lograron fenotipos BBB deseables, tal rango fisiológico de valores TEER38,39. La utilización de iPSCs tiene la ventaja de conservar el fondo genético del individuo del que se derivan las células. Los científicos están trabajando activamente en el establecimiento de modelos de microambientes ex vivo derivados de iPSC que recapitulan la estructura y la función del cerebro humano. Los investigadores han desarrollado métodos para derivar BMECs que son estructural y fisiológicamente similares a los BMECs encontrados in vivo. Los métodos para obtener poblaciones purificadas de BMECs derivados de iPSC requieren una serie de pasos diferentes con protocolos optimizados en los últimos años1,6,35,36. Generalmente, los BMECs derivados de iPSC se cultivan en el medio esencial 6 (E6) durante 4 días, seguido de 2 días en el medio libre de suero endotelial humano (hESFM) complementado con factor de crecimiento fibroblasto básico (bFGF), ácido retinoico (RA), y suplemento B27. A continuación, las células se cultivan en una matriz de colágeno IV (COL4) y fibronectina (FN) para obtener >90% BMECs homogéneos1.

La identidad de los BMECs se confirma mediante la inmunofluorescencia que muestra la coexpresión de las proteínas BMEC, incluida la molécula de adhesión de células plaquetarias-endoteliales-1 (PECAM1), SLC2A1 y proteínas de unión estrechas como la proteína de unión estrecha 1 (TJP1), la ocludina (OCLN) y claudin-5 (CLDN5)6. Los ensayos de brotes se han utilizado para confirmar el potencial angiogénico de los BMECs derivados de iPSC. 6 La integridad BBB de los BMECs se evalúa mediante la presencia de valores FIsiológicos in vitro TEER (~2000Ω x cm2)37 y actividad medible para transportadores de eflujo como ABCB1 y ABCC11,6,36. Los recientes avances metodológicos del grupo Lippmann han dado lugar a protocolos BMEC derivados de iPSC con menor variabilidad experimental y reproducibilidad mejorada1. Sin embargo, no se sabe si se pueden ampliar y pasar más allá de la etapa de sub-culto. Nuestro protocolo modificado tiene como objetivo abordar este problema pasando los BMECs derivados de iPSC más allá del día 8 y evaluando si se pueden ampliar aún más para conservar las propiedades de BBB después de la criopreservación. Aunque ningún estudio ha descrito la transferencia de BMECs derivados de iPSC, existe un protocolo para la criopreservación BMEC que retiene las propiedades fisiológicas de BBB después de someterse a un ciclo de congelación-deshielo40. Sin embargo, no se sabe después de la criopreservación BMECs se puede pasar y retener propiedades BBB.

Los BMECs derivados de iPSC utilizando el protocolo Lippmann se han utilizado para modelar la interrupción del BBB en trastornos neurológicos como la enfermedad de Huntington7. Estos BMECs derivados de iPSC también se han utilizado para investigar los efectos de la infección bacteriana como Neisseria meningitidis o Streptococcus del Grupo B en la interrupción de la barrera de la FSC en sangre y BBB respectivamente41,42. Además, utilizando BMECs derivados del iPSC de pacientes con síndrome de eliminación de 22q con esquizofrenia, los investigadores observaron un aumento de la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1), una molécula de adherencia importante en BMECs que ayudan con el reclutamiento y la extravasación de leucocitos en el cerebro43. En conjunto, estos estudios demuestran la utilidad de los BMECs derivados de iPSC para estudiar la interrupción del BBB en trastornos neuropsiquiátricos complejos.

Protocol

Los iPSC humanos fueron reprogramados de los fibroblastos de donantes sanos utilizando un protocolo aprobado por las Juntas de Revisión Institucional del Hospital General de Massachusetts y el Hospital McLean, y caracterizados como descritos en estudios anteriores44,45,46. NOTA: Brevemente, los fibroblastos fueron reprogramados a iPSC a través de la reprogramación genética basada en ARNM<sup class…

Representative Results

Diferenciación BMECAlgunos pasos críticos en este protocolo deben seguirse con precisión (Figura 1). E6 uso medio en el día 1 es importante, ya que se utiliza a menudo para derivar linaje neuroectoderm de iPSCs dentro de un período relativamente corto de tiempo que produce resultados reproducibles a través de múltiples líneas celulares36. Otro paso importante es el día 4 de la diferenciación, donde el medio E6 debe cambiarse a hESFM con …

Discussion

Modificaciones y solución de problemas

En este protocolo, hicimos algunas modificaciones en el uso de una matriz extracelular de uso común y medios de cultivo celular durante la culturing iPSC para la derivación de BMECs (Figura 1). Estos cambios no afectaron a la capacidad de derivar BMECS de iPSC humanos como se describe en el Protocolo Lippmann1. Se utilizó una línea iPSC de un donante sano diferente para demostrar …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por un Premio R01MH113858 del Instituto Nacional de Investigación Biobehavioral de Salud Mental para Nuevos Científicos Innovadores (BRAINS) R01MH113858 (a R.K.), premio KL2 TR002542 (PL) de los Institutos Nacionales de Salud. un Premio del Instituto Nacional de Desarrollo Científico Clínico de Salud Mental K08MH086846 (a R.K.), una Beca de la Fundación R Baer Jr de Sídney (a P.L.) el Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (a R.K.), la Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (a R.K.), la Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (a R.K.), el Instituto de Células Madre de Harvard (a R.K.) y por Steve Willis y Elissa Freud (a R.K.). Agradecemos a la Dra. Annie Kathuria por su lectura crítica y comentarios sobre el manuscrito.

Materials

2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
Accutase Sigma Aldrich A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A-31572
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb Cell Signaling 3528S
CLDN5 (Claudin-5) Thermo Fisher Scientific 35-2500
Collagen IV from human placenta Sigma Aldrich C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial  Corning  8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) Corning 353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) Corning 353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) Corning 3460
Countess slides Thermo Fisher Scientific C10228
DMEM/F12 (without phenol red) Thermo Fisher Scientific  A1413202
DMSO Sigma Aldrich D2438-50mL
Donkey serum Sigma Aldrich D9663-10ML
DPBS (+/+) Gibco/Thermo Fisher Scientific 14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 World Precision Instruments N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F2442
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium  Thermo Fisher Scientific 24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Human endothelial serum-free medium Thermo Fisher Scientific 11111044
InCell Analyzer 6000 General Electric N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific N/A
MK-571 Sigma Aldrich M7571-5MG
NutriStem Stemgent 01-0005
Occludin Thermo Fisher Scientific 33-1500
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Services 15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader Perkin Elmer N/A
Recombinant Human VEGF 165 Peprotech 100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625-100MG
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1) ThermoFisher PA1-21041
SOX17 Cell Signaling 81778S
TJP-1 (ZO-1) ThermoFisher PA5-28869
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) Sigma Aldrich SML0572-5MG
Versene solution Thermo Fisher Scientific 15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Tocris/Thermo Fisher Scientific 1254
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Keywords: Brain Microvascular Endothelial CellsHuman Induced Pluripotent Stem CellsBlood-brain BarrierBMEC DerivationBMEC ExpansionBMEC CryopreservationBMEC CharacterizationTEER AnalysisEfflux Transporter ActivityDisease Modeling
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Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (165), e61629, doi:10.3791/61629 (2020).
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