JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Neuroscience

Afledning, ekspansion, kryopræservering og karakterisering af hjernemikrobielle endotelceller fra menneskeskabte pluripotente stamceller

Published: November 19, 2020
doi:
10.3791/61629
, ,
1Center for Genomic Medicine,Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry,Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program,Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry,Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program,McLean Hospital

Summary

Denne protokol beskriver en tilpasset metode til at udlede, udvide og kryopreserve hjernens mikrovaskulære endotelceller opnået ved at differentiere humane inducerede pluripotente stamceller og til at studere blodhjernebarriereegenskaber i en ex vivo-model.

Abstract

Hjernemikrobielle endotelceller (BMECs) kan skelnes fra menneskeskabte pluripotente stamceller (iPSCs) for at udvikle ex vivo cellulære modeller til undersøgelse af blod-hjerne-barriere (BBB) funktion. Denne ændrede protokol indeholder detaljerede trin til at udlede, udvide og kryopræservere BMEC’er fra menneskelige iPSC’er ved hjælp af en anden donor og reagenser end dem, der er rapporteret i tidligere protokoller. IPSCs behandles med essentielle 6 medium i 4 dage, efterfulgt af 2 dage af menneskelige endotel serum-fri kultur medium suppleret med grundlæggende fibroblast vækstfaktor, retinosyre, og B27 supplement. På dag 6, er celler sub-dyrket på en kollagen / fibronectin matrix i 2 dage. Immunocytochemistry udføres på dag 8 for BMEC-markøranalyse ved hjælp af CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 og SLC2A1. Vestlig blotting udføres for at bekræfte BMEC-markørudtryk og fravær af SOX17, en endodermal markør. Angiogent potentiale demonstreres med en spirende analyse. Trans-endotel elektrisk modstand (TEER) måles ved hjælp af spisepindeelektroder og voltohmmeter fra dag 7. Efflux transportøraktivitet for ATP-bindingskassetteunderfamilie B-medlem 1 og ATP-bindende kassetteunderfamilie C-medlem 1 måles ved hjælp af en flerpladelæser på dag 8. En vellykket afledning af BMECs bekræftes af tilstedeværelsen af relevante cellemarkører, lave niveauer af SOX17, angiogent potentiale, transportaktivitet og TEER-værdier ~2000 Ω x cm2. BMECs udvides indtil dag 10, før de passerer på friskbelagte kollagen / fibronectin plader eller cryopreserved. Denne protokol viser, at iPSC-afledte BMEC’er kan udvides og passeres mindst én gang. Der blev dog observeret lavere TEER-værdier og dårligere lokalisering af BMEC-markører efter kryopræservering. BMECs kan bruges i co-kultur eksperimenter med andre celletyper (neuroner, glia, pericytes), i tre-dimensionelle hjerne modeller (organ-chip og hydrogel), for vaskularisering af hjernen organoider, og for at studere BBB dysfunktion i neuropsykiatriske lidelser.

Introduction

Blod-hjerne barriere funktion
Blod-hjerne barrieren (BBB) danner en grænse, der begrænser bevægelse af stoffer fra blodet til hjernen. BBB består af hjerne mikrovaskulære endotelceller (BMECs), der danner et monolag foring vaskulaturen. BMECs, sammen med astrocytter, neuroner, pericytes, microglia, og ekstracellulær matrix, danner neurovaskulær enhed. BMECs har en stramt reguleret paracellulær struktur, der gør det muligt for BBB at opretholde høj trans-endotel elektrisk modstand (TEER), som begrænser passiv diffusion og fungerer som en indikator for barriereintegritet1,2. BMECs har også proteiner, der hjælper med transcellulær bevægelse såsom endokytose, transcytose og transmigration samt ekstravasation af leukocytter under et immunrespons3. BMECs er afhængige af tilstrømning og efflux transportører til næring og fjernelse af affaldsprodukter, for at opretholde en homeostatic balance i hjernen3. F.eks. solute carrier family 2 member 1 (SLC2A1) er en tilstrømning transportør ansvarlig for flytning af glukose på tværs af BBB4, mens efflux transportører såsom ATP bindende kassette subfamily B medlem 1 (ABCB1) og ATP bindende kassette subfamily C medlem 1 (ABCC1) er ansvarlige for at returnere substrater tilbage i blodet3,5,6,7. ABCB1 substrater omfatter morfin, verapamil4, og antipsykotika såsom olanzapine og risperidone8, mens ABCC1 transportør har en række substrater, herunder sulfat konjugater, vincristine, og glucuronide konjugater4.

Anvendelse af BBB-modeller i psykiatriske lidelser
BBB dysfunktion har været impliceret i en række neurologiske og psykiatriske lidelser, herunder skizofreni og bipolar lidelse9,10. For nylig bruges iPSC-afledte ex vivo cellulære modeller til at afhøre det cellulære og molekylære fundament af psykiatriske lidelser, men disse modeller tager i øjeblikket ikke højde for den potentielle rolle, som neurovasculature11,12,13. Det er hypotese, at perifere inflammatoriske cytokiner, der cirkulerer iblodet,kan have en negativ indvirkning på BBB14,15,16,17, men der er også tegn på paracellulær18,19,20,21,122, transcellulær23,24,25,26,27,28,29og ekstracellulær matrix20,29,30,31,32 abnormiteter, der bidrager til BBB-dysfunktion. Forstyrrelse af BBB kan resultere i, at indholdet af blodet kommer ind i hjernen parenchyma og aktiverer astrocytter og / eller mikroglia for at frigive proinflammatoriske cytokiner, som igen indleder en inflammatoriskreaktion 33, der kan have skadelige virkninger på hjernen34. BMECs er den primære komponent i BBB og undersøge strukturen og funktionen af disse celler kan forbedre forståelsen af BBB dysfunktion i neurologiske og psykiatriske lidelser.

Alternative BMEC-modeller
Forud for udviklingen af effektive protokoller for at udlede BMECs fra iPSCs1, 6,35,36, forskere havde ansat udødeliggjort BMECs37 at studere BBB funktion. Mange af disse modeller opnåede imidlertid ikke ønskelige BBB-fænotyper, et sådant fysiologisk interval af TEER-værdier38,39. Brug af iPSCs har den fordel at bevare den genetiske baggrund af den person, hvorfra cellerne er afledt. Forskere arbejder aktivt på at etablere iPSC-afledte ex vivo mikromiljømodeller, der opsummerer strukturen og funktionen af den menneskelige hjerne. Forskere har udviklet metoder til at udlede BMECs, der er strukturelt og fysiologisk ligner BMECs findes in vivo. Metoder til opnåelse af rensede populationer af iPSC-afledte BMEC’er kræver en række forskellige trin , hvor protokollerne er optimeret i de seneste år1,6,35,36. Generelt er iPSC-afledte BMECs dyrket i Essential 6 (E6) medium i 4 dage, efterfulgt af 2 dage i humant endotel serumfrit medium (hESFM) suppleret med grundlæggende fibroblast vækstfaktor (bFGF), retinosyre (RA) og B27 supplement. Cellerne er derefter dyrket på en kollagen IV (COL4) og fibronectin (FN) matrix for at opnå >90% homogenE BMECs1.

BMEC’ernes identitet bekræftes af immunfluorescens, der viser co-ekspressionen af BMEC-proteiner, herunder blodplade-endotelcelle vedhæftningsmolekyle-1 (PECAM1), SLC2A1 og stramme krydsproteiner som stramt krydsprotein 1 (TJP1), occludin (OCLN) og claudin-5 (CLDN5)6. Spirende assays er blevet brugt til at bekræfte det angiogene potentiale i iPSC-afledte BMECs. 6 BBB-integriteten af BMEC’er vurderes ved tilstedeværelsen af fysiologiske IN VITRO TEER-værdier (~2000Ω x cm2)37 og målelig aktivitet for effluxtransportører som ABCB1 og ABCC11,6,36. Lippmann-gruppens seneste metodologiske fremskridt har ført til iPSC-afledte BMEC-protokoller med reduceret eksperimentel variation og forbedret reproducerbarhed1. Det vides dog ikke, om de kan udvides og passeres ud over underkulturfasen. Vores ændrede protokol har til formål at løse dette problem ved at videregive iPSC-afledte BMECs efter dag 8 og vurdere, om de kan udvides yderligere til at bevare BBB-egenskaber efter kryopræservering. Mens ingen undersøgelser har beskrevet passaging af iPSC-afledte BMECs, findes der en protokol for BMEC cryopreservation, der bevarer fysiologiske BBB-egenskaber efter at have gennemgået en fryse-optøningscyklus40. Det er dog ikke kendt, at BMEC’er efter kryopræservering kan passeres og bevare BBB-egenskaber.

BMECs afledt af iPSC’er ved hjælp af Lippmann-protokollen er blevet brugt til at modellere BBB-forstyrrelser i neurologiske lidelser som Huntingtons Sygdom7. Sådanne iPSC-afledte BMEC’er er også blevet anvendt til at undersøge virkningerne af bakteriel infektion som Neisseria meningitidis eller Gruppe B Streptococcus på afbrydelse af blod-CSF-barrieren og BBB henholdsvis41,42. Også ved hjælp af iPSC-afledte BMECs fra 22q sletning syndrom patienter med skizofreni, forskere observeret en stigning i intercellulær vedhæftning molekyle-1 (ICAM-1), en stor vedhæftning molekyle i BMECs, der hjælper med rekruttering og ekstravasation af leukocytter i hjernen43. Tilsammen viser disse undersøgelser nytten af iPSC-afledte BMECs til at studere BBB-forstyrrelser i komplekse neuropsykiatriske lidelser.

Protocol

Human iPSCs blev omprogrammeret fra fibroblaster af raske donorer ved hjælp af en protokol godkendt af Institutional Review Boards of Massachusetts General Hospital og McLean Hospital, og karakteriseret som beskrevet i tidligere undersøgelser44,45,46. BEMÆRK: Kort, fibroblaster blev omprogrammeret til iPSC via mRNA-baserede genetiske omprogrammering47. IPSC’erne blev opretho…

Representative Results

BMEC DifferentieringEt par kritiske skridt i denne protokol bør følges præcist (figur 1). E6 medium brug på dag 1 er vigtig, da det ofte bruges til at udlede neuroectoderm afstamning fra iPSCs inden for en relativt kort periode giver reproducerbare resultater på tværs af flere cellelinjer36. Et andet vigtigt skridt er på dag 4 i differentiering, hvor E6-medium skal skiftes til hESFM med fortyndet (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF og 10 μM RA for …

Discussion

Ændringer og fejlfinding

I denne protokol har vi foretaget nogle ændringer i brugen af en almindeligt anvendt ekstracellulær matrix og cellekultur medier under iPSC dyrkning til afledning af BMECs (Figur 1). Disse ændringer påvirkede ikke evnen til at udlede BMECS fra menneskelige iPSC’er som beskrevet i Lippmann-protokol1. Der blev anvendt en iPSC-linje fra en anden sund donor til at påvise , at denne ændrede protok…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af en National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH113858 (til R.K.), en National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL). en National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (til R.K.), en Sydney R Baer Jr Foundation Grant (til P.L.) Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (til R.K.), Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (til R.K.), Phyllis & Amp; Jerome Lyle Rappaport Foundation (til R.K.), Harvard Stem Cell Institute (til R.K.) og af Steve Willis og Elissa Freud (til R.K.). Vi takker Dr. Annie Kathuria for hendes kritiske læsning og feedback på manuskriptet.

Materials

2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
Accutase Sigma Aldrich A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A-31572
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb Cell Signaling 3528S
CLDN5 (Claudin-5) Thermo Fisher Scientific 35-2500
Collagen IV from human placenta Sigma Aldrich C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial  Corning  8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) Corning 353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) Corning 353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) Corning 3460
Countess slides Thermo Fisher Scientific C10228
DMEM/F12 (without phenol red) Thermo Fisher Scientific  A1413202
DMSO Sigma Aldrich D2438-50mL
Donkey serum Sigma Aldrich D9663-10ML
DPBS (+/+) Gibco/Thermo Fisher Scientific 14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 World Precision Instruments N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F2442
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium  Thermo Fisher Scientific 24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Human endothelial serum-free medium Thermo Fisher Scientific 11111044
InCell Analyzer 6000 General Electric N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific N/A
MK-571 Sigma Aldrich M7571-5MG
NutriStem Stemgent 01-0005
Occludin Thermo Fisher Scientific 33-1500
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Services 15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader Perkin Elmer N/A
Recombinant Human VEGF 165 Peprotech 100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625-100MG
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1) ThermoFisher PA1-21041
SOX17 Cell Signaling 81778S
TJP-1 (ZO-1) ThermoFisher PA5-28869
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) Sigma Aldrich SML0572-5MG
Versene solution Thermo Fisher Scientific 15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Tocris/Thermo Fisher Scientific 1254
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
  2. Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
  3. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  4. Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
  5. Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to “Open” the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
  6. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
  7. Lim, R. G., et al. Huntington’s Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
  8. Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
  9. Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83 (2017).
  10. Pollak, T. A., et al. The blood-brain barrier in psychosis. Lancet Psychiatry. 5, 79-92 (2018).
  11. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  12. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
  13. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
  14. Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321 (2013).
  15. Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
  16. Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
  17. Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964 (2008).
  18. Greene, C., Hanley, N., Campbell, M. Claudin-5: gatekeeper of neurological function. Fluids and Barriers of the CNS. 16, 3 (2019).
  19. Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
  20. Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia – connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
  21. Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
  22. Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15 (2014).
  23. Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
  24. Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
  25. de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
  26. Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
  27. Kimchi-Sarfaty, C., et al. A “Silent” Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  28. Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879 (2019).
  29. Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
  30. Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
  31. Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
  32. Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
  33. Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
  34. Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
  35. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2015).
  36. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9 (2017).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Barichello, T. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
  38. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  39. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33 (2013).
  40. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
  41. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181 (2019).
  42. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398 (2017).
  43. Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
  44. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321 (2019).
  45. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
  46. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34 (2020).
  47. Warren, L., Lin, C. mRNA-Based Genetic Reprogramming. Molecular Therapy. 27, 729-734 (2019).
  48. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099 (2014).
  49. Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
  50. Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
  51. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  52. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. NeuroReport. 29, 588-593 (2018).
  53. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  54. Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
  55. Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia – comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
  56. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13 (2015).

Tags

Keywords: Brain Microvascular Endothelial CellsHuman Induced Pluripotent Stem CellsBlood-brain BarrierBMEC DerivationBMEC ExpansionBMEC CryopreservationBMEC CharacterizationTEER AnalysisEfflux Transporter ActivityDisease Modeling
check_url/61629?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (165), e61629, doi:10.3791/61629 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image