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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Injeção intravitreal e quantitação de parâmetros de infecção em um modelo de rato de endophtalmite bacteriana

Published: February 6, 2021 doi: 10.3791/61749
Automatic Translation
*1,2, *1, 2,3, 4, 2,3, 1,2,3
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology, Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Descrevemos aqui um método de injeção intravitaliana e subsequente quantitação bacteriana no modelo de camundongos de endophthalmite bacteriana. Este protocolo pode ser estendido para medir as respostas imunes do hospedeiro e a expressão genética bacteriana e hospedeira.

Abstract

Infecções bacterianas intraoculares são um perigo para a visão. Pesquisadores usam modelos animais para investigar os fatores hospedeiros e bacterianos e vias de resposta imune associadas à infecção para identificar alvos terapêuticos viáveis e testar drogas para prevenir a cegueira. A técnica de injeção intravitreal é usada para injetar organismos, drogas ou outras substâncias diretamente na cavidade vítrea no segmento posterior do olho. Aqui, demonstramos essa técnica de injeção para iniciar a infecção no olho do rato e a técnica de quantificar bactérias intraoculares. Bacillus cereus foi cultivado em mídia líquida de infusão cardíaca cerebral por 18 horas e resuspended a uma concentração de 100 unidades formadoras de colônias (UFC)/0,5 μL. Um rato C57BL/6J foi anestesiado usando uma combinação de cetamina e xilazina. Usando um microinjetor picoliter e agulhas capilares de vidro, 0,5 μL da suspensão bacilo foi injetado no vitreous médio do olho do rato. O olho de controle contralateral foi injetado com mídia estéril (controle cirúrgico) ou não foi injetado (controle absoluto). Às 10 horas após a infecção, os camundongos foram eutanizados, e os olhos foram colhidos usando pinças cirúrgicas estéreis e colocadas em um tubo contendo 400 μL estéreis PBS e 1 mm de vidro estéril. Para os ensaios ELISAs ou mieloperoxidase, o inibidor de proteinase foi adicionado aos tubos. Para extração de RNA, foi adicionado o tampão de lise apropriado. Os olhos foram homogeneizados em um homogeneizador de tecido por 1-2 minutos. Os homogeneizadores foram diluídos em 10 vezes em PBS e faixa diluída em placas de ágar. O restante dos homogeneizadores foi armazenado a -80 °C para ensaios adicionais. As placas foram incubadas por 24 horas e a UFC por olho foi quantificada. Essas técnicas resultam em infecções reprodutíveis nos olhos do camundongo e facilitam a quantitação de bactérias viáveis, a resposta imune hospedeira e a omics da expressão genética hospedeira e bacteriana.

Introduction

A endophtalmite bacteriana é uma infecção devastadora que causa inflamação e, se não tratada corretamente, pode resultar em perda de visão ou cegueira. Endophtalmite resulta da entrada de bactérias no interior do olho1,2,3,4,5. Uma vez no olho, as bactérias se replicam, produzem toxinas e outros fatores nocivos, e podem causar danos irreversíveis a delicadas células e tecidos da retina. Danos oculares também podem ser causados por inflamação, devido à ativação de vias inflamatórias que levam ao influxo de células inflamatórias no interior do olho1,5,6. A endophtalmite pode ocorrer após cirurgia intraocular (pós-operatório), lesão penetrante no olho (pós-traumática), ou de propagação metastática de bactérias no olho de um sítio anatômico diferente (endógeno)7,8,9,10. Os tratamentos para endophtalmite bacteriana incluem antibióticos, anti-inflamatórios ou intervenção cirúrgica3,4,11. Mesmo com esses tratamentos, a visão ou o próprio olho podem ser perdidos. O prognóstico visual após a endophthalmitis bacteriana geralmente varia dependendo da eficácia do tratamento, da acuidade visual na apresentação e da virulência do organismo infectante.

Bacillus cereus (B. cereus)é um dos principais patógenos bacterianos que causa endophthalmite pós-traumática7,12. A maioria dos casos de endophthalmitis de B. cereus tem um curso rápido, que pode resultar em cegueira dentro de alguns dias. As marcas de Endophthalmitis B. cereus incluem inflamação intraocular em rápida evolução, dor ocular, perda rápida de acuidade visual e febre. B. cereus cresce rapidamente no olho em comparação com outras bactérias que comumente causam infecções oculares2,4,12 e possui muitos fatores de virulência. Portanto, a janela para intervenção terapêutica bem sucedida é relativamente curta1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Os tratamentos para esta infecção geralmente são bem sucedidos no tratamento da endophthalmitis causada por outros patógenos menos virulentos, mas b. cereus endophthalmitis geralmente resulta em mais de 70% dos pacientes que sofrem de perda significativa da visão. Cerca de 50% desses pacientes são submetidos à evisceração ou enucleação do olho infectado7,16,22,23. A natureza destrutiva e rápida da endophthalmitis de B. cereus exige tratamento imediato e adequado. Avanços recentes no discernimento dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento de doenças identificaram potenciais metas de intervenção19,26,27. Modelos experimentais de camundongos de Endophthalmitis B. cereus continuam a ser úteis para discernir os mecanismos de infecção e testar potenciais terapêuticas que possam prevenir a perda de visão.

A infecção intraocular experimental de camundongos com B. cereus tem sido um modelo instrumental para a compreensão de fatores bacterianos e hospedeiros, bem como suas interações, durante a endophthalmite28. Este modelo imita um evento pós-traumático ou pós-operatório, no qual bactérias são introduzidas no olho durante uma lesão. Este modelo é altamente reprodutível e tem sido útil para testar terapias experimentais e fornecer dados para melhorias no padrão de atenção1,6,19,29,30. Como muitos outros modelos de infecção, este modelo permite o controle independente de muitos parâmetros de infecção e permite um exame eficiente e reprodutível dos desfechos de infecção. Estudos em modelo semelhante em coelhos nas últimas décadas examinaram os efeitos dos fatores de virulência de B. cereus no olho2,4,13,14,31. Ao injetar cepas mutantes B. cereus sem fatores individuais ou múltiplos de virulência, a contribuição desses fatores de virulência para a gravidade da doença pode ser medida por desfechos como a concentração de bactérias em diferentes horas de pós-infecção ou a perda da função visual13,14,27,31,32. Além disso, fatores hospedeiros foram examinados neste modelo infectando cepas de camundongos nocauteados sem fatores de hospedeiro inflamatórios específicos26,29,33,34,35. O modelo também é útil para testar tratamentos potenciais para esta doença injetando novos compostos no olho após a infecção30,36. Neste manuscrito, descrevemos um protocolo detalhado que inclui infectar um olho de rato com B. cereus,colher o olho após infecção, quantificar a carga bacteriana intraocular e preservar espécimes para avaliar parâmetros adicionais de gravidade da doença.

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Protocol

Todos os procedimentos foram realizados seguindo as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e De Visão. Os protocolos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Oklahoma (números do protocolo 15-103, 18-043 e 18-087).

1. Agulhas de vidro estéreis

  1. Ligue o puxador de pipeta da agulha.
  2. Ajuste o botão aquecedor até que o visor apareça 12,6.
  3. Abra a porta e alimente manualmente o tubo capilar de 5 μL através do grampo superior e do filamento do aquecedor até que metade da tubulação se estenda abaixo do filamento(Figura 1A).
  4. Confirme se o tubo capilar está na ranhura "V" no grampo superior. Aperte o grampo superior.
  5. Com o grampo inferior aberto, ajuste manualmente o slide vertical até que o grampo inferior atinja seu limite superior. Confirme se o tubo está na ranhura "V" no grampo inferior. Aperte o grampo inferior.
  6. Feche a porta e confirme que a luz 'Pronta' está acesa. Pressione o botão Iniciar para iniciar o aquecedor e a sequência de puxar(Figura 1B).
  7. Certifique-se de que o aquecedor se desfaz automaticamente após o calor e a gravidade separarem o tubo capilar(Figura 1C),e o slide se move para baixo.
  8. Abra a porta. Enquanto segura a parte superior do tubo capilar, desfia o grampo superior. Retire o tubo capilar superior e reserve-o.
  9. Segure o tubo capilar no slide inferior e desnque o grampo inferior. Retire o tubo capilar inferior e reserve-o.
  10. Use um bipar microelerode com uma placa de moagem abrasiva de 0,05 μm de alumina para bivelar o tubo capilar puxado para criar as agulhas de injeção.
  11. Pipeta água suficiente na placa de moagem para cobrir a superfície(Figura 1D).
  12. Ligue o beveller para que comece a girar a 60 rpm. Coloque o tubo capilar puxado no grampo de pipeta na ranhura "V". Aperte o grampo e ajuste o ângulo do grampo de pipeta para 30°.
  13. Ajuste a ponta da borda pontiaguda do tubo capilar a aproximadamente dois terços da distância do centro de rotação da placa de moagem.
  14. Abaixe o tubo capilar fixado ajustando o botão de controle grosseiro na parte superior do manipulador. Continue a baixar o tubo capilar até que a ponta do tubo capilar se estenda abaixo da superfície da água e entre em contato com a superfície abrasiva da placa de moagem.
  15. Monitore o progresso do chanfrado usando o microscópio ligado ao beveller. Depois de 5 min, ajuste o controle fino para levantar a agulha de vidro da placa de moagem.
  16. Retire a agulha de vidro e coloque-a sob ampliação de 10x para verificar a ponta do tubo capilar (Figura 1E,F).
  17. Para garantir que não haja bloqueios, insira a agulha de vidro em um suporte de pipeta em uma seringa e empurre o ar para um tubo de 1 mL de 99% de etanol. Se as bolhas de ar se formarem na ponta da agulha, a agulha não tem bloqueios e pode ser usada para microinjeção. Este processo também garante a esterilidade das agulhas de vidro.
  18. Um tubo capilar pode conter até 5 μL de fluido. Marque o tubo capilar em 10 seções para calcular as distâncias na agulha para marcar para 0,5 μL de volumes. Marque uma escala com essa distância que contém 0,5 μL para preparação futura. Para uma agulha de 5 μL, distâncias de 0,7 mm de distância equivalem a 0,5 μL(Figura 1G).

2. Cultura Bacillus cereus

  1. Realize todos os procedimentos nesta seção sob condições de Biossegurança Nível 2.
  2. Estoque de congelador de b. cereus ATCC 14579 para isolamento de colônia única em uma placa de ágar de sangue de ovelha de 5% e incubar durante a noite a 37 °C (Figura 2A).
  3. Pipeta 5 mL de caldo de infusão cerebral estéril (BHI) em um tubo de tampa estéril de 10 mL(Figura 2B). Usando um laço ou agulha estéril, escolha uma única colônia de B. cereus ATCC 14579 da placa de ágar e inocular o BHI líquido.
  4. Vórtice a amostra brevemente. Coloque o tubo de tampa de estalo em uma incubadora giratória. Estafina a temperatura em 37 °C e a velocidade a 200 rpm. Após 18h, remova a cultura da incubadora (Figura 2B).

3. Diluição bacteriana para injeção intravitaliana

  1. Realize todos os procedimentos nesta seção sob condições de Biossegurança Nível 2.
  2. Calcule o volume da cultura B. cereus durante a noite para adicionar a 10 mL de BHI fresco para alcançar 200 unidades formadoras de colônias por microliter (UFC/μL). Por exemplo, uma cultura noturna de B. cereus em BHI replica-se para aproximadamente 2 x 108 UFC/mL, que pode então ser diluída para 200 UFC/μL por pipetação de 10 μL de cultura durante a noite em 10 mL de BHI fresco.
  3. Pipeta 1 mL da cultura recém-diluída em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL. Mantenha este tubo no gelo até a injeção intravitreal. Realize a injeção intravitreal dentro de 60 minutos de diluição da cultura bacteriana.

4. Injeção intravitreal do rato

  1. Realize todos os procedimentos nesta seção sob condições de Biossegurança Nível 2.
  2. Prepare o local do procedimento colocando subpads médicos na mesa de operação.
  3. Ligue o microinjetor e abra a válvula de gás no tanque de ar comprimido ligado ao microinjetor. Ajuste o regulador do tanque até que a entrega do gás seja de aproximadamente 60 psi.
  4. No microinjetor, pressione o modo até que a tela mostre Balance. Pressione balance e coloque o mouse do computador na mesa de operação. Conecte o suporte de pipeta de aço inoxidável à tubulação anexada ao 'Preenchimento/Saída' do injetor. Este tubo está sempre conectado ao injetor.
  5. Insira a agulha capilar na outra extremidade do suporte da pipeta, aparafusando o conector do suporte da pipeta ao redor da agulha.
  6. Ligue o microscópio oftálmico e ligue sua luz para uma intensidade de 50%. Ajuste o microscópio sobre o local do procedimento na tabela de operação e ajuste o microscópio para o foco desejado.
  7. Antes do procedimento começar, confirme se o mouse está adequadamente anestesiado testando o reflexo de retirada do pedal. Não deixe de seguir seu protocolo aprovado pela IACUC para anestesia.
  8. Coloque o rato anestesiado nos blocos médicos com o nariz apontado para a direita e inclinando-se para o lado esquerdo.
  9. Olhe para o olho direito do mouse através do microscópio oftálmico e abra as tampas abrindo as pinças de uma asseps de ação reversa em ambos os lados do olho para expor o local da injeção(Figura 3C).
  10. Encha a agulha capilar com a diluição de 200 UFC/μL à esquerda clicando no mouse pad conectado ao microinjetor(Figura 3D).
  11. Segure a cabeça do animal com a mão esquerda e coloque a ponta da agulha no limbus do olho. Com a agulha na posição bevel up e no ângulo de 45°, fure o olho do mouse, mas certifique-se de que apenas a ponta afiada da agulha (~0,5 mm) seja inserida ao injetar.
  12. Uma vez que a ponta da agulha seja inserida, mova a mão esquerda da cabeça do mouse para o mouse pad e clique à direita no mouse pad para injetar 0,5 μL da diluição B. cereus. Para evitar vazamentos, deixe a ponta da agulha dentro do olho do rato por 2-3 segundos antes de remover (Figura 3E)1,19,26,27,32,34,36,37,38.
  13. Solte os fórceps e coloque o rato em uma gaiola que está sentada em uma almofada de aquecimento. Monitore esses camundongos até que tenham se recuperado da anestesia(Figura 3F).
  14. Uma vez que os ratos são recuperados da anestesia, devolva a gaiola ao seu rack adequado. Se os camundongos serão submetidos à análise da função da retina por eletroretinaografia, as gaiolas devem ser devolvidas a uma sala escura para adaptação escura adequada.

5. Preparação do tubo de colheita

  1. Coloque contas de vidro estéreis de 1 mm em tubos de tampa de parafuso de 1,5 mL.
  2. Esterilize esses tubos em uma autoclave em um ambiente seco. Deixe os tubos esfriarem até a temperatura ambiente antes de usar.
  3. Adicione 10 mL de salina tamponada de fosfato estéril (PBS) a um tubo de centrífuga estéril de 15 mL.
  4. Adicione 1 comprimido de comprimido de coquetel inibidor de protease no tubo. Misture por vórtice19,27,29,34,35.
  5. Pipeta 400 μL de salina tamponada de fosfato de 1x (PBS) contendo inibidor de protease em cada tubo de colheita autoclaved. Rotule os tubos e coloque no gelo. (Figura 4A).

6. Colhendo os olhos

  1. Realize todos os procedimentos nesta seção sob condições de Biossegurança Nível 2.
  2. Eutanize o mouse por inalação de CO2. Use um método secundário para confirmar a eutanásia.
  3. Segure a cabeça do rato eutanizado segura e abra os fórceps finos de ponta em ambos os lados do olho infectado. Empurre para baixo em direção à cabeça para sustentar o olho. Uma vez que as pinças estão atrás do globo do olho, aperte as pinças juntas. Puxe fórceps para longe da cabeça para desprender o globo ocular(Figura 4B).
  4. Coloque imediatamente o globo ocular em um tubo de colheita rotulado. Coloque tubos no gelo por no máximo 60 min(Figura 4C).

7. Contagem bacteriana intraocular

  1. Realize todos os procedimentos nesta seção sob condições de Biossegurança Nível 2.
  2. Confirme se todos os tubos de colheita estão bem fechados e são equilibrados enquanto no homogeneizador de tecido(Figura 5A). Ligue o homogeneizador de tecido por 1 min para homogeneizar as amostras. Espere por 30 s, depois ligue por mais um minuto. Coloque tubos no gelo(Figura 5B,C).
  3. Diluir cada amostra em 10 vezes transferindo sequencialmente 20 μL do homogeneado para 180 μL de PBS 1x estéril. Diluir até que um fator de 10-7 seja atingido(Figura 5D).
  4. Rotule cada linha de uma placa BHI quente e quadrada com os fatores de diluição adequados. Transfira 10 μL de cada diluição seguida para a placa bhi superior que é inclinada aproximadamente 45°. Deixe a amostra funcionar até que quase atinja a parte inferior da placa, em seguida, coloque a placa plana (Figura 5E)39.
  5. Quando a amostra for absorvida no ágar BHI, transfira a placa para uma incubadora de 37 °C. As colônias devem começar a ser visíveis 8h após serem colocadas na incubadora.
  6. Retirar a placa da incubadora antes que o crescimento das colônias B. cereus interfira na identificação de colônias individuais(Figura 5F).
  7. Para uma representação precisa da concentração na amostra, conte a linha que tem entre 10-100 colônias. Por exemplo, uma linha com a fração de diluição de 10-4 que tem 45 colônias terá uma concentração de 4,5 x 105 UFC/mL.
  8. Para calcular o número total de bactérias por olho, multiplique a concentração por 0,4, o que representa o volume mililitro de 1x PBS usado para homogeneizar o olho. Por exemplo, a concentração de 4,5 x 105 UFC/mL se traduziria em 1,8 x 105 CFU B. cereus por olho.

8. Preservação de amostras

  1. Coloque amostras homogeneizadas em uma caixa de congelador rotulada e coloque esta caixa em um congelador de -80 °C. Estas amostras podem ser utilizadas posteriormente para análise de mediadores inflamatórios pela ELISA.

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Representative Results

Gerar um inóculo reprodutível e precisão do procedimento de injeção intravitreal são passos fundamentais no desenvolvimento de modelos de endophthalmite microbiana. Aqui, demonstramos o procedimento de injeção intravitreal usando Bacillus cereusGram-positivo . Injetamos 100 UFC/0,5 μL de B. cereus no meio do vitreous de cinco camundongos C57BL6. Após 10h de pós-infecção, observou-se crescimento intraocular de B. cereus para aproximadamente 1,8 x 105 UFC/olho. A Figura 1 demonstra a construção de agulhas de vidro para entregar as bactérias no meio dos olhos do rato. Bacillus cereus crescendo em uma placa de ágar de sangue e em tubos de cultura é mostrado na Figura 2. A Figura 3 mostra o procedimento de injeção intravitreal do mouse usando um sistema de injeção pressurizada por ar. A Figura 4 demonstra o processo de colheita dos olhos infectados após o tempo desejado pós-infecção. A Figura 5 mostra a técnica de homogeneização dos olhos infectados. A Figura 6 demonstra a contagem de bactérias intraoculares a partir de cinco diferentes olhos de rato a 10h de pós-infecção. A Figura 7 retrata o procedimento geral e uma representação gráfica de uma injeção intravitreal do mouse.

Figure 1
Figura 1: Fazendo agulhas de vidro chanfradas. Agulhas de vidro foram feitas de pipetas microcapilary descartáveis usando um puxador de agulha/pipeta e um beveler de micropipette. (A) Tubo capilar de vidro preso no puxador de agulha/pipeta. (B,C) Criação de agulhas de vidro usando a tensão desejada. (D)Chancesing os micropipettos de vidro. (E,F) Micropipettos de vidro antes e depois de chanfrarar. (E) Dimensionamento das agulhas de vidro. O espaço entre dois pontos pretos é de 0,5 μL. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Bacillus cereus ATCC 14579. (A) Bacillus cereus crescendo em uma placa de ágar de sangue. Colônias individuais de B. cereus normalmente exibem zonas claras de hemólise em uma placa de ágar de sangue. (B) Culturas turvas da noite para o dia de B. cereus. (C) Mancha de grama de B. cereus. B. cereus são bactérias em forma de vara gram-positivas. (D) Micrografia eletrônica de Bacillus cereus. Este micrografo eletrônico mostra bacillus cereus em forma de vara com cabelos como estruturas chamadas flagela. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Injeção intravitreal do rato. O procedimento de injeção é realizado usando um injetor de ar pressurizado com visualização do campo de operação usando um microscópio comercial (A) cetamina e xilazina para anestesiar o mouse. (B) Administração de cetamina e xilazina por injeção intraperitoneal para anestesiar o camundongo. (C) Fixação da pele periocular para sustentar o olho. (D) Encher as agulhas com bactérias usando o injetor pressurizado de ar. (E) Injeção intravitreal. (F) Monitoramento do camundongo infectado após anestesia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Colher o olho infectado pelo rato. Após a infecção, após o ponto de tempo desejado, colher olhos de rato infectados usando pinças estéreis. (A) PBS contendo contas de vidro estéreis. (B) Colheita do olho infectado. (C) Tubo de colheita contendo um olho de rato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Processamento do olho colhido para contagem bacteriana intraocular. (A) Tubo de colheita com olho infectado preso firmemente a um homogeneizador de tecido. (B) Os olhos infectados foram homogeneizados duas vezes por 1 min cada. Diluição de faixa(D)dos homogeneizadores dos olhos(C) e posterior revestimento(E)para a quantitação bacteriana. (E) Representante individual colônia Bacillus cereus após diluição da faixa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: A contagem de bactérias intraoculares em 10h de pós-infecção. M, número do rato. CFU, unidades formadoras de colônias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Injeção intravitreal do rato. (A) Fluxograma geral do procedimento de injeção intravitreal do mouse. (B) Apresentação gráfica da injeção intravitreal. Durante o procedimento, agulhas de vidro estéreis e chanfradas contendo uma cultura de B. cereus são inseridas no meio do olho do rato, e B. cereus são entregues usando um sistema de microinjeção pressurizado a ar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Mesmo com a disponibilidade de antibióticos potentes, anti-inflamatórios e cirurgia de vitrectomia, a endophtalmite bacteriana pode cegar um paciente. Estudos clínicos têm sido úteis no estudo da endophthalmite; no entanto, modelos experimentais de endophthalmitis proporcionam resultados rápidos e reprodutíveis que podem ser traduzidos para o progresso no padrão de cuidado, resultando em melhor resultado visual para os pacientes.

O volume vítreo do olho do rato é de aproximadamente 7 μL40. Este pequeno volume só permite que uma quantidade limitada de material seja injetada. Volumes superiores a 1,0 μL não devem ser injetados para evitar danos oculares. O processo requer equipamentos específicos e prática de técnicas para garantir a reprodutibilidade e a precisão. A endophtalmite tem sido estudada em primatas, suínos, coelhos, ratos, cobaias e no rato28,41,42,43,44,45. Entre as espécies maiores, os olhos são muito mais próximos em tamanho dos olhos humanos, e injeções intravitreal em olhos maiores podem ser realizadas sem equipamento especial. Com exceção do camundongo, a ausência de cepas e reagentes para estudar as respostas imunes do hospedeiro em outros modelos animais restringe sua utilidade na endophthalmite experimental.

A endophtalmite ocorre com maior frequência como uma complicação da cirurgia de catarata. Essa infecção também pode ocorrer após trauma ocular penetrante ou infecção sistêmica. O desfecho visual nesta doença depende, em parte, da virulência do patógeno infectante. Em camundongos, o resultado visual também depende de seu estado imunológico. A compreensão dos mecanismos da patogênese da doença tem sido facilitada pelo estudo da doença em modelos animais experimentais28. O protocolo para injeção intravitareal do camundongo e a quantificação dos parâmetros de infecção podem ser adaptados para estudar a endophthalmite iniciada com quase qualquer tipo de patógeno bacteriano ou fúngico28. Além disso, este protocolo também pode ser aplicado e modificado para estudar alterações anatômicas, processos inflamatórios e os perfis de expressão genética tanto da bactéria quanto do hospedeiro durante a infecção.

A injeção intravitreal do rato e a análise subsequente dos parâmetros de infecção consistem em várias etapas críticas(Figura 7). A agulha de vidro deve ser criada, marcada e esterilizada com precisão. A ponta afiada da agulha de vidro chanfrada e o dimensionamento adequado determina o fornecimento adequado das bactérias e punção do globo. Se a extremidade da agulha for curta e não for adequadamente chanfrada, pode criar um grande buraco no globo que poderia causar vazamento, contaminação do globo e um resultado impreciso da doença. Portanto, recomenda-se observar os micropipettos de vidro enquanto chanfra sob zoom óptico de 10x de um microscópio de campo brilhante. Para garantir a entrega da quantidade correta de bactérias, as diluições devem ser calculadas com antecedência, e a escala de volume adequada deve ser marcada na agulha de vidro. Os parâmetros para puxar agulhas e bisbisar usando outros tipos de equipamento podem variar.

A técnica de injeção intravitreal descrita utiliza um sistema microinjetor pressurizado a ar para a entrega adequada da bactéria no olho do rato1. O uso adequado deste microinjetor é crucial para os parâmetros de infecção reprodutível. Uma vez que a pressão do ar determina a velocidade de entrega, a força excessiva pode injetar rapidamente um volume maior nos olhos, causando pressão intraocular excessiva e/ou ruptura de globo. Portanto, a recomendação é usar uma pressão de 10-13 psi para preencher e injetar durante o procedimento. Outro problema potencial é o vazamento da solução bacteriana das agulhas de vidro após o enchimento. Vazamento pode resultar na injeção de volumes imprecisos nos olhos do rato. Verifique sempre as conexões entre o sistema de injeção, tubos e agulhas de vidro antes das injeções.

Injetar quantidades precisas de bactérias é vital para a reprodutibilidade da endophtalmite bacteriana experimental. Diferentes modelos experimentais de endophtalmite requerem inoculação de números específicos de bactérias12,28,46,47,48,49. Para b. cereus endophthalmitis, a injeção de 100 UFC é necessária para iniciar uma infecção reprodutível1. Uma vez que o crescimento bacteriano depende do meio de crescimento e das condições, o ambiente de crescimento, a mídia e as diluições devem ser repetidas a cada vez. Portanto, recomenda-se testar as condições de cultura antes do experimento para reproduzir o inóculo preciso no volume apropriado para injeção. Como observado acima, o limite superior para injeção intravitreal nos olhos do mouse é de 1,0 μL28. Um volume excessivo eleva a pressão intraocular que pode resultar em glaucoma, desprender a retina do segmento posterior ou romper o globo. A injeção intravitreal e a infecção resultante em camundongos podem não imitar perfeitamente a endophthalmite B. cereus em um humano. A maioria dos modelos animais de doença humana são limitados desta forma. Quantidades conhecidas de B. cereus são injetadas no olho após o crescimento em mídia rica em nutrientes. Para os casos clínicos de Endophthalmitis B. cereus, as quantidades infecciosas não são conhecidas e as fontes de contaminação variam. No entanto, as vantagens de usar organismos caracterizados e cepas de camundongos e gerar cursos de infecção reprodutível superam essas limitações.

A colheita adequada dos olhos infectados é outro passo crítico. A manutenção das condições assépticas é essencial para evitar qualquer contaminação cruzada que possa interferir na interpretação dos dados. Portanto, a recomendação é desinfetar a bancada e todos os instrumentos com 70% de etanol antes da colheita. Os números bacterianos aumentam rapidamente dentro do ambiente vítreo durante a infecção, o que pode causar inchaço no olho. Portanto, deve-se tomar cuidado para remover suavemente o olho durante a colheita, evitar a ruptura do globo. Além disso, a tampa do tubo de colheita contendo o olho infectado deve ser adequadamente apertada antes de colocar o tubo em homogeneizador de tecido. Uma tampa solta resultará em vazamento e contaminação do homogeneizador tecidual levando à quantitação imprecisa de bactérias nos tubos de vazamento. O procedimento de homogeneização dos olhos também eleva as temperaturas dos tubos. Portanto, recomenda-se homogeneizar 1 minuto de cada vez. Temperaturas elevadas podem afetar a quantitação de alguns parâmetros de infecção. Embora este método não forneça o número de bactérias em locais específicos do olho, quando combinado com métodos histológicos, podemos estimar onde as bactérias podem ser localizadas. A localização de B. cereus no olho durante a endophthalmitis tem sido relatada em coelhos, cujos olhos são maiores e mais facilmente dissecados em subcoentadores. 2

A injeção intravitreal imita a entrega de organismos ao segmento posterior do olho, que inicia a infecção. Esta etapa inicial facilita o estudo qualitativo e quantitativo dos parâmetros de infecção em um modelo de camundongos altamente reprodutível de endophthalmite experimental. Esses modelos também são usados para estimar a inflamação ocular quantificando a mieloperoxidase na infiltração de neutrófilos, identificando tipos celulares específicos por citometria de fluxo, quantificando citocinas e quimiocinas por PCR em tempo real e/ou ELISA, e observando arquitetura ocular por histopatologia1,6,19,20,26,27,34,35,38. Os olhos do rato infectado são colhidos com diferentes diluentes, dependendo do tipo de parâmetros de infecção a serem medidos. Para análise de expressão genética, é necessário um tampão de lise diferente26. Para o exame histopatológico, os olhos colhidos são colocados em uma solução fixa. A multiplicidade de camundongos genéticos também facilita o estudo do papel de vários fatores imunológicos e células. A injeção intravitreal é, portanto, uma técnica de base para pesquisadores no campo de infecções intraoculares e terapêuticas.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos financeiros para divulgar.

Acknowledgments

Os autores agradecem ao Dr. Feng Li e Mark Dittmar (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, USA) por sua ajuda. Nossa pesquisa foi apoiada pelos Institutos Nacionais de Saúde bolsas R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 e R01EY024140. Nossa pesquisa também foi apoiada pelo P30EY21725 (bolsa NIH CORE para Imagem e Análise De Animais Vivos, Biologia Molecular e Imagem Celular). Nossa pesquisa também foi apoiada pelo programa de pré-doutorado NEI Vision Science 5T32EY023202, uma bolsa de apoio à pesquisa da Fundação Presbiteriana de Saúde e uma bolsa irrestrita ao Instituto Desaprocurado A. McGee Eye de Pesquisa para Prevenir a Cegueira.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-20 µL pipette RANIN L0696003G NA
37oC Incubator Fisher Scientific 11-690-625D NA
Bacto Brain Heart Infusion BD 90003-032 NA
Cell Microinjector MicroData Instrument, Inc. PM2000 NA
Fine tip forceps Thermo Fisher Scientific 12-000-122 NA
Glass beads 1.0 mm BioSpec 11079110 NA
Incubator Shaker New Brunswick Scientific NB-I2400 NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters Kimble 71900-5 NA
Micro-Pipette Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 NA
Microscope Axiostar Plus Zeiss NA
Microscope OPMI Lumera Zeiss NA
Mini-Beadbeater-16 BioSpec Model 607 NA
Multichannel pipette 30-300 µL Biohit 15626090 NA
Multichannel pipette 5-100 µL Biohit 9143724 NA
Needle/Pipette Puller Kopf 730 NA
PBS GIBCO 1897315 Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001 Molecular grade
Reverse action forceps Katena K5-8228 NA

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References

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Injeção intravitreal e quantitação de parâmetros de infecção em um modelo de rato de endophtalmite bacteriana
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