En hydrofobisk vævsclearingmetode til rottehjernevæv

Summary

Her præsenterer vi en hydrofobisk vævsclearingmetode, der giver mulighed for visning af målmolekyler som en del af intakte hjernestrukturer. Denne teknik er nu blevet valideret for F344/N kontrol og HIV-1 transgene rotter af begge køn.

Abstract

Hydrofobe vævsclearingmetoder er let justerbare, hurtige og billige procedurer, der giver mulighed for undersøgelse af et molekyle af interesse for uændrede vævsprøver. Traditionelle immunolabelingsprocedurer kræver, at prøven skæres i tynde sektioner, hvilket begrænser evnen til at mærke og undersøge intakte strukturer. Men hvis hjernevævet kan forblive intakt under behandlingen, kan strukturer og kredsløb forblive intakte til analysen. Tidligere etablerede clearingmetoder tager betydelig tid at rydde vævet fuldstændigt, og de hårde kemikalier kan ofte skade følsomme antistoffer. IDISCO-metoden rydder hurtigt og fuldstændigt væv, er kompatibel med mange antistoffer og kræver intet specielt laboratorieudstyr. Denne teknik blev oprindeligt valideret til brug i mus væv, men den nuværende protokol tilpasser denne metode til billedet halvkugler af kontrol og transgene rotte hjerner. Derudover foretager denne protokol også flere justeringer af den allerede eksisterende protokol for at give klarere billeder med mindre baggrundsplejning. Antistoffer for Iba-1 og tyrosinhydroxylase blev valideret i hiv-1-transgene rotter og i F344/N-kontrolrotter ved hjælp af den nuværende hydrofobe vævsclearingmetode. Hjernen er et sammenvævet netværk, hvor strukturer arbejder sammen oftere end hver for sig. Analyse af hjernen som et helt system i modsætning til en kombination af individuelle stykker er den største fordel ved hele denne hjerne clearing metode.

Introduction

Flere væv clearing teknikker er blevet valideret til brug i hjernen: hydrogel, hydrofil, og hydrofobisk. Disse teknikker har til formål at gøre et væv gennemsigtigt gennem afføring, affarvning og afkalkning via indgift af opløsningsmidler. Når vævsprøvens brydningsindeks svarer til det valgte billedmediums brydningsindeks, kan der opnås et klart billede af prøven. Hydrogelbaserede teknikker, såsom KLARHED, sikrer biomolekyler i vævet ved at forbinde dem med akrylsbaserede hydrogeler, som forhindrer strukturelle skader og tab af proteiner¹. Hydrogel-teknikker anvender imidlertid barske kemikalier end har potentiale til at beskadige mere skrøbelige væv, og tættere vævsprøver er muligvis ikke kompatible med hydrogelprotokollen. Visse hydrogel teknikker kan kræve dyrt udstyr eller føre til væv ekspansion. Hydrofile teknikker, som CUBIC, bevarer 3D-struktur gennem dannelsen af hydrogenbindinger i vævet². Vævsudvidelse kan også forekomme i visse hydrofile protokol. De hydrofile teknikkers clearingevne matcher ofte ikke den evne, som hydrofobe teknikker har, hvilket er vigtigt for tættere og tykkere væv³.

Hydrofobe teknikker er normalt hurtige, kræver ikke specielt udstyr og producerer en prøve, der er let at håndtere og opbevare. iDISCO er en hydrofobisk teknik, der eliminerer krympning, der kan forekomme i andre hydrofobe protokol. Oprindeligt blev iDISCO-vævsclearingteknikken beskrevet af Renier et al.⁴ for embryoner og tætte, voksne organer hos mus. Denne teknik fjerner vand fra vævet i det indledende dehydreringstrin og reducerer derved lysspredningen. Væv er gennemtrængelig under forbehandling at tillade dyb antistof penetration. Alexa Fluor farvestoffer i det langt røde spektrum bruges til immunolabeling for at undgå autofluorescens af vævet ved lavere bølgelængder⁵. Væv, der har gennemgået hydrofobe clearing protokoller er i stand til at håndteres nemt og kan afbildes flere gange på grund af levetiden af Alexa Fluor farvestoffer. Hvis de opbevares korrekt, kan væv give billeder i måneder til et år efter den første behandling.

I denne protokol blev tyrosinhydrafylase (TH) antistof, Iba1 antistof og Koleratoksin subunit B (CTB) anvendt på både mandlig og kvindelig kontrol og HIV-1 transgene (Tg) rottehjerner. HIV-1 Tg-rotten besidder syv af de ni gener, der udgør HIV-1 viralt genom, hvilket fører til en ikke-infektiøs model for langvarig HIV-1 proteineksponering^6,7,8. Dopaminergiske ændringer er tidligere blevet påvist i HIV-1 Tg-rotten, og HIV-1 i sig selv er en inflammatorisk sygdom, så antistofvalget var relevant for det eksperimentelle design^9,10,11,12. CTB er en sporstof, der tillægger neuroner via ganglioside bindende og kan bruges til at spore afferente fremskrivninger i hjernen. CTB har tidligere været brugt til at studere fremskrivninger fra kernen accumbens til substantia nigra området, to områder af hjernen stærkt involveret med dopaminergiske veje^13,14,15.

I denne protokol vil TH fungere som en markør for dopaminproduktion, og Iba1 vil markere aktiveret mikroglia. Det anvendte TH-antistof mærker selektivt et enkelt bånd på ca. 62 kDa, der svarer til tyrosinhydroxylase. Iba1-antistoffet svarer til Iba1-carboxyterminalsekvensen. Begge antistoffer blev opdrættet i kanin og var polyklonale. CTB vil blive anvendt til retrograd sporing af neuroner fra kernen accumbens område til substantia nigra området. Den nuværende protokol indeholder også en retningslinje for justering af den oprindelige iDISCO-protokol på to forskellige måder: 1) samlet reduktion af baggrundsfarvningen ved at ændre serumreagenserne i blokeringstrinnene og 2) skalering af inkubationstiden for at være egnet til større vævsprøver. Samlet set giver denne protokol fortsat bevis for, at hydrofobe clearingteknikker er mulige i rotters hjernevæv, ikke har nogen mærkbar skadelig interaktion med HIV-1-virusproteiner og er kompatible med TH-antistof, Iba1-antistof og CTB.

Protocol

Alle dyreprotokoller blev gennemgået og godkendt af Animal Care and Use Committee ved University of South Carolina. 1. Forberedelse af stamopløsning Opløsning 1 (1 L): Til 900 ml deioniseret H2O tilsættes 100 ml 10x fosfat buffered saltvand (PBS) og 2 ml Triton X-100. Opløsning 2 (1 L): Til 900 ml deioniseret H2O tilsættes 100 ml 10x PBS, 2 ml Tween-20 og 1 ml 10 mg/mL Heparin-stamopløsning. Opløsning 3 (500 ml): Til 400 ml opløsning…

Representative Results

Fuld rydning af store dele af både F344/N og HIV-1 rottehjernevæv blev opnået ved hjælp af denne modificerede hydrofobe vævsclearingprotokol. Figur 1 viser et typisk konfokalt billede for TH i substantia nigra-regionen. Figur 1A repræsenterer tæt, positiv farvning. Tætte områder som disse kan analyseres ud ved at fokusere gennem “Z” plan for at bekræfte positiv farvning og korrekt celle morfologi. Figur 1B repræsenterer s…

Discussion

Vævsrydning tilbyder en løsning på begrænsningerne i den traditionelle IHC-protokol. En prøve, der er gennemsigtig minimerer spredning og absorption af lys, som giver cellulært niveau optisk adgang til intakt væv^18,19. Vævsrydningsteknikker gør et væv gennemsigtigt gennem aflipidation, affarvning og afkalkning ved administration af opløsningsmidler. Når vævsprøvens brydningsindeks svarer til det brydningsindeks for det valgte billedmedium, vises pr?…

Materials

Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488	Invitrogen	C34775
DBE	Sigma-Aldrich	108014-1KG
DCM	Sigma-Aldrich	270997-100mL
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-1L
Glycine	Fisher Chemical	G46-500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647	Invitrogen	A32733
Goat serum	Sigma Life Science	G9023-10mL
Heparin	Acros Organics	41121-0010
Iba1 primary antibody	FUJIFILM Wako	019-19741
Kwik-sil epoxy	VWR	70730-062
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1l-R
PBS	Fisher Bioreagents	BP2944-100
Perfusion machine	VWR	70730-062	mini pump variable flow
PFA	Sigma-Aldrich	158127-3KG
TH primary antibody	Millipore Sigma	AB152
TritonX-100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Tween-20	Fisher Bioreagents	BP337-500