Un método de limpieza de tejido hidrófobo para el tejido cerebral de rata
Summary
Aquí presentamos un método de limpieza de tejido hidrofóbico que permite la visualización de moléculas objetivo como parte de estructuras cerebrales intactas. Esta técnica ha sido validada para el control de F344/N y ratas transgénicas VIH-1 de ambos sexos.
Abstract
Los métodos de limpieza de tejido hidrofóbico son procedimientos fácilmente ajustables, rápidos y de bajo costo que permiten el estudio de una molécula de interés en muestras de tejido inalteradas. Los procedimientos tradicionales de inmunoetiquetado requieren cortar la muestra en secciones delgadas, lo que restringe la capacidad de etiquetar y examinar estructuras intactas. Sin embargo, si el tejido cerebral puede permanecer intacto durante el procesamiento, las estructuras y los circuitos pueden permanecer intactos para el análisis. Los métodos de limpieza previamente establecidos toman un tiempo significativo para limpiar completamente el tejido, y los productos químicos agresivos a menudo pueden dañar los anticuerpos sensibles. El método iDISCO elimina rápida y completamente el tejido, es compatible con muchos anticuerpos y no requiere equipo de laboratorio especial. Esta técnica fue validada inicialmente para su uso en tejido de ratones, pero el protocolo actual adapta este método a la imagen de hemisferios de cerebros de ratas de control y transgénicos. Además de esto, el protocolo actual también realiza varios ajustes al protocolo preexistente para proporcionar imágenes más claras con menos manchas de fondo. Los anticuerpos para Iba-1 y tirosina hidroxilasa se validaron en la rata transgénica VIH-1 y en ratas control F344/N utilizando el actual método de limpieza de tejido hidrófobo. El cerebro es una red entrelazada, donde las estructuras trabajan juntas más a menudo que separadamente unas de otras. Analizar el cerebro como un sistema completo en lugar de una combinación de piezas individuales es el mayor beneficio de todo este método de limpieza cerebral.
Introduction
Se han validado varias técnicas de limpieza de tejidos para su uso en el cerebro: hidrogel, hidrófilo e hidrófobo. Estas técnicas tienen como objetivo hacer que un tejido sea transparente a través de la delipidación, la decoloración y la descalcificación a través de la administración de disolventes. Una vez que el índice de refracción de la muestra de tejido coincide con el índice de refracción del medio de imagen elegido, se puede obtener una imagen clara de la muestra. Las técnicas basadas en hidrogel, como CLARITY, aseguran las biomoléculas en el tejido uniéndolas a hidrogeles a base de acrilo, lo que evita el daño estructural y la pérdida de proteínas1. Sin embargo, las técnicas de hidrogel utilizan productos químicos agresivos que tienen el potencial de dañar tejidos más frágiles, y las muestras de tejido más densas pueden no ser compatibles con el protocolo de hidrogel. Ciertas técnicas de hidrogel pueden requerir equipos costosos o conducir a la expansión del tejido. Las técnicas hidrófilas, como CUBIC, preservan la estructura 3D a través de la formación de enlaces de hidrógeno dentro del tejido2. La expansión del tejido también puede ocurrir en cierto protocolo hidrófilo. La capacidad de limpieza de las técnicas hidrofílicas a menudo no coincide con la capacidad que tienen las técnicas hidrofóbicas, lo cual es importante para tejidos más densos y gruesos3.
Las técnicas hidrofóbicas suelen ser rápidas, no requieren equipos especiales y producen una muestra que es fácil de manejar y almacenar. iDISCO es una técnica hidrofóbica que elimina la contracción que puede producirse en otros protocolos hidrófobos. Originalmente, la técnica de limpieza de tejidos iDISCO fue descrita por Renier et al.4 para los embriones y órganos densos y adultos de ratones. Esta técnica elimina el agua del tejido en el paso inicial de deshidratación, reduciendo así la dispersión de la luz. El tejido se permeabiliza durante el pretratamiento para permitir la penetración profunda de anticuerpos. Los colorantes Alexa Fluor en el espectro rojo lejano se utilizan para el inmunoetiquetado para evitar la autofluorescencia del tejido en longitudes de onda más bajas5. El tejido que se ha sometido a protocolos de limpieza hidrofóbica se puede manejar fácilmente y se puede obtener imágenes varias veces debido a la longevidad de los tintes Alexa Fluor. Si se almacenan adecuadamente, los tejidos pueden proporcionar imágenes durante meses a un año después del procesamiento inicial.
En el presente protocolo, el anticuerpo tirosina hidroxilasa (TH), el anticuerpo Iba1 y la subunidad B de la toxina del cólera (CTB) se utilizaron en el control masculino y femenino y en los cerebros de ratas transgénicas (Tg) del VIH-1. La rata VIH-1 Tg posee siete de los nueve genes que componen el genoma viral del VIH-1, lo que conduce a un modelo no infeccioso de exposición a largo plazo a la proteína VIH-16,7,8. Las alteraciones dopaminérgicas se han demostrado previamente en la rata VIH-1 Tg, y el VIH-1 en sí es una enfermedad inflamatoria, por lo que la elección del anticuerpo fue relevante para el diseño experimental9,10,11,12. CTB es un trazador que se adhiere a las neuronas a través de la unión gangliósido y se puede utilizar para rastrear proyecciones aferentes en el cerebro. CTB se ha utilizado previamente para estudiar proyecciones desde el núcleo accumbens hasta el área de la sustancia negra, dos áreas del cerebro muy involucradas con las vías dopaminérgicas13,14,15.
En este protocolo, TH servirá como marcador para la producción de dopamina, e Iba1 marcará la microglía activada. El anticuerpo TH utilizado marca selectivamente una sola banda a aproximadamente 62 kDa que corresponde a la tirosina hidroxilasa. El anticuerpo Iba1 corresponde a la secuencia carboxi-terminal Iba1. Ambos anticuerpos fueron criados en conejo y eran policlonales. CTB se utilizará para el rastreo retrógrado de neuronas desde el área del núcleo accumbens hasta el área de la sustancia negra. El protocolo actual también ofrece una guía para el ajuste del protocolo iDISCO original de dos maneras distintas: 1) reducción general de la tinción de fondo mediante el cambio de los reactivos séricos en los pasos de bloqueo, y 2) escalado del tiempo de incubación para que sea adecuado para muestras de tejido más grandes. En general, el presente protocolo proporciona evidencia continua de que las técnicas de limpieza hidrofóbica son factibles en los tejidos cerebrales de la rata, no tienen interacciones perjudiciales discernibles con las proteínas virales del VIH-1 y son compatibles con el anticuerpo TH, el anticuerpo Iba1 y el CTB.
Protocol
Representative Results
Discussion
La limpieza de tejidos ofrece una solución a las limitaciones del protocolo IHC tradicional. Una muestra que es transparente minimiza la dispersión y absorción de la luz, lo que proporciona acceso óptico a nivel celular a los tejidos intactos18,19. Las técnicas de limpieza de tejidos vuelven un tejido transparente a través de la delipidación, decoloración y descalcificación con la administración de disolventes. Una vez que el índice de refracción de l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por subvenciones de los NIH: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 y por T32 Training Grant 5T32GM081740
Materials
| Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | C34775 | |
| DBE | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
| DCM | Sigma-Aldrich | 270997-100mL | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-1L | |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-500 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647 | Invitrogen | A32733 | |
| Goat serum | Sigma Life Science | G9023-10mL | |
| Heparin | Acros Organics | 41121-0010 | |
| Iba1 primary antibody | FUJIFILM Wako | 019-19741 | |
| Kwik-sil epoxy | VWR | 70730-062 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1l-R | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP2944-100 | |
| Perfusion machine | VWR | 70730-062 | mini pump variable flow |
| PFA | Sigma-Aldrich | 158127-3KG | |
| TH primary antibody | Millipore Sigma | AB152 | |
| TritonX-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Tween-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
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