Гидрофобный метод очистки тканей для ткани мозга крыс

Summary

Здесь мы представляем гидрофобный метод очистки тканей, который позволяет рассматривать молекулы-мишени как часть неповрежденных структур мозга. Этот метод в настоящее время подтвержден для борьбы с F344/N и трансгенных крыс с ВИЧ-1 обоих полов.

Abstract

Гидрофобные методы очистки тканей — это легко регулируемые, быстрые и недорогие процедуры, которые позволяют изучать интересующую молекулу в неизмененных образцах тканей. Традиционные процедуры иммуномаркировки требуют разрезания образца на тонкие срезы, что ограничивает возможность маркировки и изучения неповрежденных структур. Однако, если ткань мозга может оставаться неповрежденной во время обработки, структуры и схемы могут оставаться нетронутыми для анализа. Ранее установленные методы очистки занимают значительное время, чтобы полностью очистить ткани, а агрессивные химические вещества часто могут повредить чувствительные антитела. Метод iDISCO быстро и полностью очищает ткани, совместим со многими антителами и не требует специального лабораторного оборудования. Этот метод был первоначально одобрен для использования в тканях мышей, но текущий протокол адаптирует этот метод к изображению полушарий контроля и трансгенного мозга крыс. В дополнение к этому, настоящий протокол также вносит несколько корректировок в ранее существовавающий протокол, чтобы обеспечить более четкие изображения с меньшим фоновым окрашиванием. Антитела к Iba-1 и тирозингидрилазе были подтверждены у трансгенных крыс с ВИЧ-1 и у контрольных крыс F344/N с использованием настоящего гидрофобного метода очистки тканей. Мозг представляет собой переплетеную сеть, где структуры работают вместе чаще, чем по отдельности друг от друга. Анализ мозга как целой системы в отличие от комбинации отдельных частей является наибольшим преимуществом этого метода очистки всего мозга.

Introduction

Несколько методов очистки тканей были проверены для использования в головном мозге: гидрогелевые, гидрофильные и гидрофобные. Эти методы направлены на то, чтобы сделать ткань прозрачной путем делипидации, обесцвечивания и декальцирования путем введения растворителей. Как только показатель преломления образца ткани соответствует индексу преломления выбранной среды визуализации, может быть получено четкое изображение образца. Методы на основе гидрогеля, такие как CLARITY, защищают биомолекулы в ткани, связывая их с гидрогелями на основе акрилов, что предотвращает структурное повреждение и потерю белков^1. Тем не менее, методы гидрогеля используют агрессивные химические вещества, которые могут повредить более хрупкие ткани, и более плотные образцы тканей могут быть несовместимы с протоколом гидрогеля. Некоторые методы гидрогеля могут потребовать дорогостоящего оборудования или привести к расширению тканей. Гидрофильные методы, такие как CUBIC, сохраняют 3D-структуру путем образования водородных связей внутри^{ткани 2.} Расширение тканей также может происходить в определенном гидрофильном протоколе. Очищающая способность гидрофильных методов часто не соответствует способности, которой обладают гидрофобные методы, что важно для более плотных и толстых тканей^3.

Гидрофобные методы, как правило, быстрые, не требуют специального оборудования и производят образец, который прост в обращении и хранении. iDISCO – это гидрофобный метод, который устраняет усадку, которая может возникнуть в другом гидрофобном протоколе. Первоначально метод очистки тканей iDISCO был описан Renier et al.⁴ для эмбрионов и плотных взрослых органов мышей. Этот метод удаляет воду из ткани на начальной ступени обезвоживания, тем самым уменьшая рассеяние света. Ткань проницаема во время предварительной обработки, чтобы обеспечить глубокое проникновение антител. Красители Alexa Fluor в дальне-красном спектре используются для иммуномаркировки, чтобы избежать автофлуоресценции ткани на более низких длинах волн^5. Ткани, прошедшие гидрофобные протоколы очистки, могут легко обрабатываться и могут быть изображены несколько раз благодаря долговечности красителей Alexa Fluor. При правильном хранении ткани могут предоставлять изображения в течение нескольких месяцев до года после первоначальной обработки.

В настоящем протоколе антитело к тирозингидроксилазе (TH), антитело Iba1 и субъединица токсина холеры B (CTB) использовались как на мужском, так и на женском контроле и трансгенном (Tg) мозге крыс с ВИЧ-1. Крыса ВИЧ-1 Tg обладает семью из девяти генов, составляющих вирусный геном ВИЧ-1, что приводит к неинфекционной модели длительного воздействия белка ВИЧ-1^6,7,8. Дофаминергические изменения ранее были продемонстрированы у крысы с ВИЧ-1 Tg, а сам ПОИВ-ВИЧ-1 является воспалительным заболеванием, поэтому выбор антител был актуален для экспериментальной конструкции^9,10,11,12. CTB – это индикатор, который прикрепляется к нейронам через связывание ганглиозидов и может быть использован для отслеживания афферентных проекций в мозге. CTB ранее использовался для изучения проекций от прилежания ядра к области нигры субстанции, двух областей мозга, сильно связанных с дофаминергическими путями^13,14,15.

В этом протоколе TH будет служить маркером для выработки дофамина, а Iba1 будет маркивать активированную микроглию. Используемое антитело TH избирательно маркирует одну полосу при приблизительно 62 кДа, что соответствует тирозинде гидроксилазе. Антитело Iba1 соответствует карбокси-терминальной последовательности Iba1. Оба антитела были выращенные у кролика и были поликлональными. CTB будет использоваться для ретроградного отслеживания нейронов от области прилежащих ядер до области substantia nigra. Текущий протокол также предлагает руководство по корректировке оригинального протокола iDISCO двумя различными способами: 1) общее уменьшение фонового окрашивания путем изменения реагентов сыворотки на этапах блокировки и 2) масштабирование времени инкубации, чтобы быть пригодным для более крупных образцов тканей. В целом, настоящий протокол предоставляет постоянные доказательства того, что методы гидрофобной очистки возможны в тканях мозга крысы, не имеют заметных вредных взаимодействий с вирусными белками ВИЧ-1 и совместимы с антителами TH, антителами Iba1 и CTB.

Protocol

Все протоколы для животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Южной Каролины. 1. Приготовление раствора на складе Раствор 1 (1 л): К 900 мл деионизированногоH2O добавляют 100 мл 10x фосфатного буферного физиол…

Representative Results

Полная очистка больших участков ткани мозга крыс f344/N и ВИЧ-1 была достигнута с использованием этого модифицированного протокола очистки гидрофобной ткани. На рисунке 1 показано типичное конфокальное изображение для TH в области черновой субстанции. Рисунок 1?…

Discussion

Очистка тканей предлагает решение ограничений традиционного протокола IHC. Прозрачный образец минимизирует рассеяние и поглощение света, что обеспечивает оптический доступ на клеточном уровне к неповрежденным тканям^18,19. Методы очистки тканей превращаю…

Materials

Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488	Invitrogen	C34775
DBE	Sigma-Aldrich	108014-1KG
DCM	Sigma-Aldrich	270997-100mL
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-1L
Glycine	Fisher Chemical	G46-500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647	Invitrogen	A32733
Goat serum	Sigma Life Science	G9023-10mL
Heparin	Acros Organics	41121-0010
Iba1 primary antibody	FUJIFILM Wako	019-19741
Kwik-sil epoxy	VWR	70730-062
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1l-R
PBS	Fisher Bioreagents	BP2944-100
Perfusion machine	VWR	70730-062	mini pump variable flow
PFA	Sigma-Aldrich	158127-3KG
TH primary antibody	Millipore Sigma	AB152
TritonX-100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Tween-20	Fisher Bioreagents	BP337-500