Een hydrofobe weefselopruimingsmethode voor rattenhersenweefsel

Summary

Hier presenteren we een hydrofobe weefselontruimingsmethode die het mogelijk maakt om doelmoleculen te bekijken als onderdeel van intacte hersenstructuren. Deze techniek is nu gevalideerd voor F344/N-bestrijding en HIV-1 transgene ratten van beide geslachten.

Abstract

Hydrofobe weefselontruimingsmethoden zijn eenvoudig instelbare, snelle en goedkope procedures die het mogelijk maken om een molecuul te bestuderen dat van belang is in ongewijzigde weefselmonsters. Traditionele immunolabelingprocedures vereisen het snijden van het monster in dunne secties, wat het vermogen om intacte structuren te labelen en te onderzoeken beperkt. Als hersenweefsel echter intact kan blijven tijdens de verwerking, kunnen structuren en circuits intact blijven voor de analyse. Eerder vastgestelde clearingmethoden nemen veel tijd in om het weefsel volledig te zuiveren en de agressieve chemicaliën kunnen vaak gevoelige antilichamen beschadigen. De iDISCO-methode zuivert snel en volledig weefsel, is compatibel met veel antilichamen en vereist geen speciale laboratoriumapparatuur. Deze techniek werd aanvankelijk gevalideerd voor het gebruik in muizenweefsel, maar het huidige protocol past deze methode aan beeldhelften van controle en transgene rattenhersenen aan. Daarnaast maakt het huidige protocol ook verschillende aanpassingen aan het reeds bestaande protocol om duidelijkere beelden te bieden met minder achtergrondkleuring. Antilichamen voor Iba-1 en tyrosinehydroxylase werden gevalideerd bij de HIV-1 transgene rat en bij F344/N-controleratten met behulp van de huidige hydrofobe weefselopruimingsmethode. De hersenen zijn een verweven netwerk, waar structuren vaker samenwerken dan afzonderlijk van elkaar. Het analyseren van de hersenen als een heel systeem in tegenstelling tot een combinatie van individuele stukken is het grootste voordeel van deze hele hersenontruimingsmethode.

Introduction

Verschillende weefselophelderingstechnieken zijn gevalideerd voor gebruik in de hersenen: hydrogel, hydrofiele en hydrofobe. Deze technieken zijn erop gericht om een weefsel transparant te maken door delipidatie, ontkleuring en ontkalking via de toediening van oplosmiddelen. Zodra de brekingsindex van het weefselmonster overeenkomt met de brekingsindex van het gekozen beeldvormingsmedium, kan een duidelijk beeld van het monster worden verkregen. Hydrogel gebaseerde technieken, zoals CLARITY, beveiligen biomoleculen in het weefsel door ze te koppelen aan hydrogels op acrylbasis, die structurele schade en verlies van eiwitten voorkomen¹. Hydrogeltechnieken maken echter gebruik van agressieve chemicaliën dan het potentieel hebben om meer fragiele weefsels te beschadigen, en dichtere weefselmonsters zijn mogelijk niet compatibel met het hydrogelprotocol. Bepaalde hydrogeltechnieken kunnen dure apparatuur vereisen of leiden tot weefselexpansie. Hydrofiele technieken, zoals CUBIC, behouden de 3D-structuur door de vorming van waterstofbindingen in het weefsel². Weefselexpansie kan ook optreden in een bepaald hydrofiel protocol. Het clearingvermogen van hydrofiele technieken komt vaak niet overeen met het vermogen dat hydrofobe technieken hebben, wat belangrijk is voor dichtere en dikkere weefsels³.

Hydrofobe technieken zijn meestal snel, vereisen geen speciale apparatuur en produceren een monster dat gemakkelijk te hanteren en op te slaan is. iDISCO is een hydrofobe techniek die de krimp elimineert die kan optreden in andere hydrofobe protocollen. Oorspronkelijk werd de iDISCO weefselopruimingstechniek beschreven door Renier et al.⁴ voor de embryo’s en dichte, volwassen organen van muizen. Deze techniek verwijdert water uit het weefsel in de eerste uitdrogingsstap, waardoor de lichtverstrooiing wordt verminderd. Weefsel wordt gepermeabiliseerd tijdens de voorbehandeling om diepe antilichaampenetratie mogelijk te maken. Alexa Fluor kleurstoffen in het ver-rode spectrum worden gebruikt voor immunolabeling om autofluorescentie van het weefsel bij lagere golflengten te voorkomen⁵. Weefsel dat hydrofobe clearingprotocollen heeft ondergaan, kan gemakkelijk worden behandeld en kan meerdere keren worden afgebeeld vanwege de levensduur van de Alexa Fluor-kleurstoffen. Indien goed opgeslagen, kunnen weefsels beelden leveren gedurende maanden tot een jaar na de eerste verwerking.

In dit protocol werden tyrosine hydroxylase (TH) antilichamen, Iba1 antilichaam en Cholera Toxin Subunit B (CTB) gebruikt op zowel mannelijke als vrouwelijke controle en HIV-1 transgene (Tg) rattenhersenen. De HIV-1 Tg-rat bezit zeven van de negen genen waaruit het hiv-1 virale genoom bestaat, wat leidt tot een niet-infectieus model van langdurige hiv-1-eiwitblootstelling^6,7,8. Dopaminerge veranderingen zijn eerder aangetoond bij de HIV-1 Tg-rat en HIV-1 zelf is een ontstekingsziekte, dus de antilichaamkeuze was relevant voor het experimentele ontwerp^9,10,11,12. CTB is een tracer die zich via gangliosidebinding aan neuronen hecht en kan worden gebruikt om afferente projecties in de hersenen te traceren. CTB is eerder gebruikt voor het bestuderen van projecties van de nucleus accumbens naar het substantia nigra-gebied , twee gebieden van de hersenen die sterk betrokken zijn bij dopaminerge routes^13,14,15.

In dit protocol zal TH dienen als een marker voor dopamineproductie en Iba1 zal geactiveerde microglia markeren. Het gebruikte TH-antilichaam labelt selectief een enkele band van ongeveer 62 kDa die overeenkomt met tyrosinehydroxylase. Het Iba1-antilichaam komt overeen met de Iba1 carboxy-terminale sequentie. Beide antilichamen werden bij konijnen gekweekt en waren polyklonaal. CTB zal worden gebruikt voor retrograde tracering van neuronen van het nucleus accumbens-gebied naar het substantia nigra-gebied. Het huidige protocol biedt ook een richtlijn voor aanpassing van het oorspronkelijke iDISCO-protocol op twee verschillende manieren: 1) algehele vermindering van de achtergrondkleuring door het veranderen van de serumreagentia in de blokkeringsstappen, en 2) het schalen van de incubatietijd om geschikt te zijn voor grotere weefselmonsters. Over het algemeen levert het huidige protocol voortdurend bewijs dat hydrofobe clearingtechnieken haalbaar zijn in hersenweefsels van de rat, geen waarneembare schadelijke interacties hebben met HIV-1 virale eiwitten en compatibel zijn met TH-antilichamen, Iba1-antilichamen en CTB.

Protocol

Alle dierprotocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van de Universiteit van South Carolina. 1. Bereiding van voorraadoplossing Oplossing 1 (1 L): Voeg aan 900 ml gedeïdentiseerde H2O 100 ml 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 2 ml Triton X-100 toe. Oplossing 2 (1 L): Voeg aan 900 ml gedeïoniseerde H2O 100 ml 10x PBS, 2 ml Tween-20 en 1 ml heparinevoorraadoplossing van 10 mg/ml toe. Oplossing …

Representative Results

Volledige clearing van grote delen van zowel F344/N als HIV-1 rat hersenweefsel werd bereikt met behulp van dit gemodificeerde hydrofobe weefsel clearing protocol. Figuur 1 toont een typische confocale afbeelding voor TH in het substantia nigra-gebied. Figuur 1A staat voor dichte, positieve kleuring. Dichte gebieden zoals deze kunnen worden uitgeleed door zich door het “Z”-vlak te concentreren om positieve kleuring en de juiste celmorfologie te bevestigen. <stro…

Discussion

Weefselontruiming biedt een oplossing voor de beperkingen van het traditionele IHC-protocol. Een monster dat transparant is, minimaliseert de verstrooiing en absorptie van licht, wat optische toegang op cellulair niveau biedt tot intacte weefsels^18,19. Weefselontruimingstechnieken maken een weefsel transparant door delipidatie, ontkleuring en ontkalking met de toediening van oplosmiddelen. Zodra de brekingsindex van het weefselmonster overeenkomt met de brekingsi…

Materials

Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488	Invitrogen	C34775
DBE	Sigma-Aldrich	108014-1KG
DCM	Sigma-Aldrich	270997-100mL
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-1L
Glycine	Fisher Chemical	G46-500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647	Invitrogen	A32733
Goat serum	Sigma Life Science	G9023-10mL
Heparin	Acros Organics	41121-0010
Iba1 primary antibody	FUJIFILM Wako	019-19741
Kwik-sil epoxy	VWR	70730-062
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1l-R
PBS	Fisher Bioreagents	BP2944-100
Perfusion machine	VWR	70730-062	mini pump variable flow
PFA	Sigma-Aldrich	158127-3KG
TH primary antibody	Millipore Sigma	AB152
TritonX-100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Tween-20	Fisher Bioreagents	BP337-500