Un metodo di compensazione del tessuto idrofobico per il tessuto cerebrale del ratto

Summary

Qui presentiamo un metodo di compensazione del tessuto idrofobico che consente la visualizzazione di molecole bersaglio come parte di strutture cerebrali intatte. Questa tecnica è stata ora convalidata per il controllo F344 / N e ratti transgenici HIV-1 di entrambi i sessi.

Abstract

I metodi di compensazione dei tessuti idrofobici sono procedure facilmente regolabili, veloci e a basso costo che consentono lo studio di una molecola di interesse in campioni di tessuto inalterati. Le tradizionali procedure di immunolabeling richiedono il taglio del campione in sezioni sottili, il che limita la capacità di etichettare ed esaminare le strutture intatte. Tuttavia, se il tessuto cerebrale può rimanere intatto durante l’elaborazione, le strutture e i circuiti possono rimanere intatti per l’analisi. I metodi di compensazione precedentemente stabiliti richiedono molto tempo per eliminare completamente il tessuto e le sostanze chimiche aggressive possono spesso danneggiare gli anticorpi sensibili. Il metodo iDISCO elimina rapidamente e completamente i tessuti, è compatibile con molti anticorpi e non richiede attrezzature di laboratorio speciali. Questa tecnica è stata inizialmente convalidata per l’uso nel tessuto dei topi, ma l’attuale protocollo adatta questo metodo agli emisferi di controllo e ai cervelli transgenici dei ratti. Oltre a questo, il presente protocollo apporta anche diverse modifiche al protocollo preesistente per fornire immagini più chiare con meno macchie di sfondo. Gli anticorpi per Iba-1 e tirosina idrossilasi sono stati convalidati nel ratto transgenico HIV-1 e nei ratti di controllo F344/N utilizzando l’attuale metodo di compensazione dei tessuti idrofobici. Il cervello è una rete intrecciata, in cui le strutture lavorano insieme più spesso che separatamente l’una dall’altra. Analizzare il cervello come un intero sistema rispetto a una combinazione di singoli pezzi è il più grande vantaggio di questo metodo di compensazione dell’intero cervello.

Introduction

Diverse tecniche di pulizia dei tessuti sono state convalidate per l’uso nel cervello: idrogel, idrofilo e idrofobo. Queste tecniche mirano a trasformare un tessuto trasparente attraverso la delipidazione, la decolorazione e la decalcificazione attraverso la somministrazione di solventi. Una volta che l’indice di rifrazione del campione di tessuto corrisponde all’indice di rifrazione del mezzo di imaging scelto, è possibile ottenere un’immagine chiara del campione. Le tecniche a base di idrogel, come CLARITY, proteggono le biomolecole nel tessuto collegandole agli idrogel a base di acrilico, che prevengono danni strutturali e perdita di proteine¹. Tuttavia, le tecniche di idrogel utilizzano sostanze chimiche aggressive che hanno il potenziale di danneggiare i tessuti più fragili e campioni di tessuto più densi potrebbero non essere compatibili con il protocollo idrogel. Alcune tecniche di idrogel possono richiedere attrezzature costose o portare all’espansione dei tessuti. Le tecniche idrofile, come CUBIC, preservano la struttura 3D attraverso la formazione di legami idrogeno all’interno del tessuto². L’espansione tissutale può verificarsi anche in alcuni protocolli idrofili. La capacità di compensazione delle tecniche idrofile spesso non corrisponde alla capacità che hanno le tecniche idrofobiche, che è importante per i tessuti più densi e più spessi³.

Le tecniche idrofobiche sono solitamente veloci, non richiedono attrezzature speciali e producono un campione facile da maneggiare e conservare. iDISCO è una tecnica idrofoba che elimina il restringimento che può verificarsi in altri protocolli idrofobici. Originariamente, la tecnica di compensazione dei tessuti iDISCO è stata descritta da Renier et al.⁴ per gli embrioni e gli organi densi e adulti dei topi. Questa tecnica rimuove l’acqua dal tessuto nella fase iniziale di disidratazione, riducendo così la dispersione della luce. Il tessuto viene permeabilizzato durante il pretrattamento per consentire la penetrazione profonda degli anticorpi. I coloranti Alexa Fluor nello spettro rosso lontano sono utilizzati per l’immunolabeling per evitare l’autofluorescenza del tessuto a lunghezze d’onda inferiori⁵. I tessuti che sono stati sottoposti a protocolli di clearing idrofobico sono in grado di essere maneggiati facilmente e possono essere ripresi più volte grazie alla longevità dei coloranti Alexa Fluor. Se conservati correttamente, i tessuti possono fornire immagini per mesi o un anno dopo l’elaborazione iniziale.

Nel presente protocollo, l’anticorpo tirosina idrossilasi (TH), l’anticorpo Iba1 e la subunità B della tossina del colera (CTB) sono stati utilizzati sia sul cervello di ratto maschile che femminile e transgenico HIV-1 (Tg). Il ratto HIV-1 Tg possiede sette dei nove geni che compongono il genoma virale dell’HIV-1, che porta a un modello non infettivo di esposizione a lungo termine alla proteina HIV-1^6,7,8. Alterazioni dopaminergiche sono state precedentemente dimostrate nel ratto HIV-1 Tg e l’HIV-1 stesso è una malattia infiammatoria, quindi la scelta degli anticorpi era rilevante per il disegno sperimentale^9,10,11,12. CTB è un tracciante che si attacca ai neuroni tramite il legame gangliosidico e può essere utilizzato per tracciare proiezioni afferenti nel cervello. La CTB è stata precedentemente utilizzata per studiare le proiezioni dal nucleo accumbens all’area della substantia nigra, due aree del cervello fortemente coinvolte con le vie dopaminergiche^13,14,15.

In questo protocollo, TH servirà come marcatore per la produzione di dopamina e Iba1 segnerà la microglia attivata. L’anticorpo TH utilizzato etichetta selettivamente una singola banda a circa 62 kDa che corrisponde alla tirosina idrossilasi. L’anticorpo Iba1 corrisponde alla sequenza carbossi-terminale Iba1. Entrambi gli anticorpi sono stati allevati nel coniglio ed erano policlonali. La CTB sarà utilizzata per il tracciamento retrogrado dei neuroni dall’area del nucleo accumbens all’area della substantia nigra. L’attuale protocollo offre anche una linea guida per l’adeguamento del protocollo iDISCO originale in due modi distinti: 1) riduzione complessiva della colorazione di fondo modificando i reagenti sierici nelle fasi di blocco e 2) ridimensionamento del tempo di incubazione per essere adatto a campioni di tessuto più grandi. Nel complesso, il presente protocollo fornisce prove continue che le tecniche di clearing idrofobico sono fattibili nei tessuti cerebrali del ratto, non hanno interazioni dannose distinguibili con le proteine virali hiv-1 e sono compatibili con l’anticorpo TH, l’anticorpo Iba1 e il CTB.

Protocol

Tutti i protocolli degli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura e l’uso degli animali presso l’Università della Carolina del Sud. 1. Preparazione della soluzione stock Soluzione 1 (1 L): A 900 mL di H2O deionizzato aggiungere 100 mL di 10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e 2 mL di Triton X-100. Soluzione 2 (1 L): a 900 mL di H2O deionizzato, aggiungere 100 mL di PBS 10x, 2mL di Tween-20 e 1 mL di soluzione stock…

Representative Results

La completa eliminazione di ampie sezioni di tessuto cerebrale di ratto F344 / N e HIV-1 è stata ottenuta utilizzando questo protocollo di compensazione del tessuto idrofobico modificato. La Figura 1 mostra una tipica immagine confocale per TH nella regione substantia nigra. La Figura 1A rappresenta una colorazione densa e positiva. Aree dense come queste possono essere analizzate concentrandosi attraverso il piano “Z” per confermare la colorazione positiva e l…

Discussion

La pulizia dei tessuti offre una soluzione ai limiti del protocollo IHC tradizionale. Un campione trasparente riduce al minimo la dispersione e l’assorbimento della luce, che fornisce accesso ottico a livello cellulare ai tessuti intatti^18,19. Le tecniche di pulizia dei tessuti trasformano un tessuto trasparente attraverso la delipidazione, la decolorazione e la decalcificazione con la somministrazione di solventi. Una volta che l’indice di rifrazione del campion…

Materials

Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488	Invitrogen	C34775
DBE	Sigma-Aldrich	108014-1KG
DCM	Sigma-Aldrich	270997-100mL
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-1L
Glycine	Fisher Chemical	G46-500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647	Invitrogen	A32733
Goat serum	Sigma Life Science	G9023-10mL
Heparin	Acros Organics	41121-0010
Iba1 primary antibody	FUJIFILM Wako	019-19741
Kwik-sil epoxy	VWR	70730-062
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1l-R
PBS	Fisher Bioreagents	BP2944-100
Perfusion machine	VWR	70730-062	mini pump variable flow
PFA	Sigma-Aldrich	158127-3KG
TH primary antibody	Millipore Sigma	AB152
TritonX-100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Tween-20	Fisher Bioreagents	BP337-500