ラット脳組織の疎水性組織除去法

Summary

ここでは、インタクトな脳構造の一部として標的分子を観察することを可能にする疎水性組織クリアリング法を提示する。この技術は現在、両方の男女のF344/ NコントロールおよびHIV-1トランスジェニックラットについて検証されている。

Abstract

疎水性組織のクリアリング方法は、容易に調整可能で、速く、そして、不変の組織サンプルの目的の分子の研究を可能にする低コストのプロシージャである。従来の免疫標識法では、サンプルを薄い部分に切断する必要があり、無傷の構造にラベルを付け、検査する能力が制限されます。しかし、処理中に脳組織がそのまま残る場合、構造や回路は解析のためにそのまま残ることができます。以前に確立された清算方法は、組織を完全にクリアするのにかなりの時間がかかり、過酷な化学物質はしばしば敏感な抗体を損傷する可能性があります。iDISCO法は、組織を迅速かつ完全にクリアし、多くの抗体と互換性があり、特別なラボ機器を必要としません。この技術は、マウス組織での使用のために最初に検証されたが、現在のプロトコルは、制御およびトランスジェニックラット脳の半球を画像化するためにこの方法を適応させる。これに加えて、本プロトコルは、より少ない背景染色でより鮮明な画像を提供するために、既存のプロトコルにいくつかの調整を行います。Iba-1およびチロシンヒドロキシラーゼに対する抗体は、本疎水性組織除去法を用いてHIV-1トランスジェニックラット及びF344/N対照ラットで検証された。脳は、構造が互いに別々よりも頻繁に一緒に働く織り交ぜられたネットワークです。個々の部分の組み合わせとは対照的に、システム全体として脳を分析することは、この脳全体のクリアリング方法の最大の利点です。

Introduction

いくつかの組織クリアリング技術は、脳内での使用のために検証されている:ヒドロゲル、親水性、および疎水性。これらの技術は、溶媒の投与を介して脱脂、脱色、および脱灰を通じて組織を透明にすることを目指しています。組織試料の屈折率が選択した撮像媒体の屈折率と一致すると、サンプルの鮮明な画像が得られる。CLARITYなどのヒドロゲルベースの技術は、それらをアクリルベースのヒドロゲルにリンクすることによって組織中の生体分子を固定し、タンパク質^の構造的損傷および損失を防ぐ。しかし、ヒドロゲル技術は、より脆弱な組織を損傷する可能性を持つよりも過酷な化学物質を利用し、より密度の高い組織サンプルはヒドロゲルプロトコルと互換性がない可能性があります。ある種のヒドロゲル技術は、高価な機器を必要とするか、組織の膨張につながる可能性があります。親水性の技術は、CUBICのような、組織内の水素結合の形成を通じて3D構造を保存^する2。組織の膨張はまた、特定の親水性プロトコルで起こり得る。親水性技術のクリア能は、疎水性技術が有する能力と一致しないことが多く、これはより密度が高く、より厚い組織³にとって重要である。

疎水性の技術は、通常、高速で、特別な機器を必要とせず、取り扱い、保管が容易なサンプルを製造します。iDISCOは、他の疎水性プロトコルで起こり得る収縮を排除する疎水性技術です。もともと、iDISCO組織除去技術は、マウスの胚および緻密な成人器官に対するRenier et⁴ によって記述された。この技術は、初期脱水工程で組織から水分を除去し、光散乱を低減させる。組織は、深い抗体の浸透を可能にするために、前処理中に透過化されます。遠赤色スペクトルのアレクサ蛍光色素は、低波長⁵で組織の自己蛍光を避けるために免疫標識に使用される。疎水性のクリアリングプロトコルを受けた組織は容易に扱うことができる、Alexa Fluor染料の長寿のために数回イメージすることができる。適切に保存されていれば、組織は初期処理後数ヶ月から1年の画像を提供することができます。

本プロトコルにおいて、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)抗体、Iba1抗体、およびコレラ毒素サブユニットB(CTB)は、男性および女性の両方のコントロールおよびHIV-1トランスジェニック(Tg)ラット脳に使用された。HIV-1 Tgラットは、HIV-1ウイルスゲノムを構成する9つの遺伝子のうち7個を有し、これは長期HIV-1タンパク質暴露^6、7、8の非感染モデルをもたらす。ドーパミン作動性変化は、HIV-1 Tgラットで以前に実証されており、HIV-1自体は炎症性疾患であるため、抗体選択は実験計画^{9、10、11、12}に関連していた。CTBは、神経節側結合を介してニューロンに付着し、脳内の発泡性突起を追跡するために使用することができるトレーサーです。CTBは以前、副坐核から実質的なニグラ領域への突起を研究するために使用されてきたが、ドーパミン作動経路^13、14、15に深く関与する脳の2つの領域。

このプロトコルでは、THはドーパミン産生のマーカーとして機能し、Iba1は活性化ミクログリアをマークします。TH抗体は、チロシンヒドロキシラーゼに対応する約62kDaで単一のバンドを選択的に標識します。Iba1抗体は、Iba1カルボキシ末端配列に対応します。両方の抗体はウサギで育てられ、ポリクローナルであった。CTBは、核accumbens領域から実質的なニグラ領域へのニューロンの逆行トレースに使用されます。現在のプロトコルはまた、2つの異なる方法で元のiDISCOプロトコルの調整のためのガイドラインを提供しています:1)ブロッキングステップで血清試薬を変更することによってバックグラウンド染色の全体的な減少、および2)より大きな組織サンプルに適したインキュベーション時間のスケーリング。全体として、本プロトコルは、疎水性除去技術がラットの脳組織において実現可能であり、HIV-1ウイルスタンパク質との識別可能な有害相互作用を有せず、TH抗体、Iba1抗体およびCTBと互換性があるという継続的な証拠を提供する。

Protocol

すべての動物のプロトコルは、サウスカロライナ大学の動物ケアと使用委員会によって見直され、承認されました。 1. ストックソリューションの準備 溶液1(1 L):900mLの脱イオン化H2Oは、100mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と2mLのトリトンX-100を加える。 溶液2(1 L):脱イオン化H2Oの900mLに、10x PBSの100mL、Tween-20の2mL、10mg/mLヘパリンストック溶液の1mL…

Representative Results

F344/NおよびHIV-1ラットの両方の脳組織の大きなセクションの完全なクリアは、この修飾された疎水性組織クリアリングプロトコルを使用して達成された。 図1 は、立証ニグラ領域におけるTHの典型的な共焦点像を示す。 図1Aは 、密な正の染色を示す。このような密集した領域は、正の染色と適切な細胞形態を確認するために「Z」平面を通して焦点?…

Discussion

組織のクリアリングは、従来のIHCプロトコルの限界に対するソリューションを提供します。透明な試料は、光の散乱および吸収を最小限に抑え、無傷の組織^18,19への細胞レベルの光学的アクセスを提供する。組織クリア技術は、脱脂、脱色、および溶媒の投与による脱灰によって組織を透明にする。組織試料の屈折率が選択した撮像媒体の屈折率と…

Materials

Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488	Invitrogen	C34775
DBE	Sigma-Aldrich	108014-1KG
DCM	Sigma-Aldrich	270997-100mL
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-1L
Glycine	Fisher Chemical	G46-500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647	Invitrogen	A32733
Goat serum	Sigma Life Science	G9023-10mL
Heparin	Acros Organics	41121-0010
Iba1 primary antibody	FUJIFILM Wako	019-19741
Kwik-sil epoxy	VWR	70730-062
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1l-R
PBS	Fisher Bioreagents	BP2944-100
Perfusion machine	VWR	70730-062	mini pump variable flow
PFA	Sigma-Aldrich	158127-3KG
TH primary antibody	Millipore Sigma	AB152
TritonX-100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Tween-20	Fisher Bioreagents	BP337-500