Eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode für Rattenhirngewebe
Summary
Hier stellen wir eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode vor, die es ermöglicht, Zielmoleküle als Teil intakter Gehirnstrukturen zu betrachten. Diese Technik wurde nun für die F344/N-Kontrolle und HIV-1 transgene Ratten beiderlei Geschlechts validiert.
Abstract
Hydrophobe Gewebereinigungsmethoden sind leicht einstellbare, schnelle und kostengünstige Verfahren, die die Untersuchung eines Moleküls von Interesse in unveränderten Gewebeproben ermöglichen. Herkömmliche Immunmarkierungsverfahren erfordern das Schneiden der Probe in dünne Abschnitte, was die Fähigkeit einschränkt, intakte Strukturen zu kennzeichnen und zu untersuchen. Wenn jedoch Hirngewebe während der Verarbeitung intakt bleiben kann, können Strukturen und Schaltkreise für die Analyse intakt bleiben. Zuvor etablierte Clearing-Methoden brauchen viel Zeit, um das Gewebe vollständig zu reinigen, und die aggressiven Chemikalien können oft empfindliche Antikörper schädigen. Die iDISCO-Methode räumt Gewebe schnell und vollständig, ist mit vielen Antikörpern kompatibel und erfordert keine spezielle Laborausrüstung. Diese Technik wurde ursprünglich für den Einsatz in Mäusegewebe validiert, aber das aktuelle Protokoll passt diese Methode an die Abbildung von Hemisphären von Kontroll- und transgenen Rattengehirnen an. Darüber hinaus nimmt das vorliegende Protokoll auch mehrere Anpassungen am bereits vorhandenen Protokoll vor, um klarere Bilder mit weniger Hintergrundflecken zu liefern. Antikörper gegen Iba-1 und Tyrosinhydroxylase wurden bei der transgenen HIV-1-Ratte und bei F344/N-Kontrollratten mit der vorliegenden hydrophoben Gewebereinigungsmethode validiert. Das Gehirn ist ein verwobenes Netzwerk, in dem Strukturen häufiger zusammenarbeiten als getrennt voneinander. Die Analyse des Gehirns als Gesamtsystem im Gegensatz zu einer Kombination einzelner Teile ist der größte Vorteil dieser gesamten Gehirnreinigungsmethode.
Introduction
Mehrere Gewebereinigungstechniken wurden für den Einsatz im Gehirn validiert: Hydrogel, hydrophil und hydrophob. Diese Techniken zielen darauf ab, ein Gewebe durch Entgiftung, Entfärbung und Entkalkung durch die Verabreichung von Lösungsmitteln transparent zu machen. Sobald der Brechungsindex der Gewebeprobe mit dem Brechungsindex des gewählten Bildgebungsmediums übereinstimmt, kann ein klares Bild der Probe erhalten werden. Hydrogel-basierte Techniken wie CLARITY sichern Biomoleküle im Gewebe, indem sie mit Hydrogelen auf Acrylbasis verbunden werden, was strukturelle Schäden und den Verlust von Proteinen verhindert1. Hydrogel-Techniken verwenden jedoch aggressive Chemikalien, die das Potenzial haben, zerbrechlichere Gewebe zu schädigen, und dichtere Gewebeproben sind möglicherweise nicht mit dem Hydrogel-Protokoll kompatibel. Bestimmte Hydrogeltechniken können teure Geräte erfordern oder zu einer Gewebeausdehnung führen. Hydrophile Techniken, wie CUBIC, bewahren die 3D-Struktur durch die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen im Gewebe2. Gewebeerweiterung kann auch in bestimmten hydrophilen Protokollen auftreten. Die Clearingfähigkeit hydrophiler Techniken entspricht oft nicht der Fähigkeit hydrophober Techniken, die für dichtere und dickere Gewebe wichtig ist3.
Hydrophobe Techniken sind in der Regel schnell, erfordern keine spezielle Ausrüstung und produzieren eine Probe, die einfach zu handhaben und zu lagern ist. iDISCO ist eine hydrophobe Technik, die die Schrumpfung beseitigt, die in anderen hydrophoben Protokollen auftreten kann. Ursprünglich wurde die iDISCO Gewebereinigungstechnik von Renier et al.4 für die Embryonen und dichten, adulten Organe von Mäusen beschrieben. Diese Technik entfernt dem Gewebe im ersten Austrocknungsschritt Wasser und reduziert so die Lichtstreuung. Gewebe wird während der Vorbehandlung permeabilisiert, um eine tiefe Antikörperpenetration zu ermöglichen. Alexa Fluor Farbstoffe im fernroten Spektrum werden zur Immunmarkierung verwendet, um autofluoreszenz des Gewebes bei niedrigeren Wellenlängen zu vermeiden5. Gewebe, das hydrophoben Clearing-Protokollen unterzogen wurde, kann leicht gehandhabt und aufgrund der Langlebigkeit der Alexa Fluor-Farbstoffe mehrmals abgebildet werden. Bei richtiger Lagerung können Gewebe nach der ersten Verarbeitung Monate bis zu einem Jahr lang Bilder liefern.
Im vorliegenden Protokoll wurden Tyrosinhydroxylase (TH) Antikörper, Iba1 Antikörper und Cholera Toxin Subunit B (CTB) sowohl bei männlichen und weiblichen Kontroll- als auch bei HIV-1 transgenen (Tg) Rattengehirnen eingesetzt. Die HIV-1 Tg-Ratte besitzt sieben der neun Gene, aus denen das HIV-1-Virusgenom besteht, was zu einem nicht-infektiösen Modell der langfristigen HIV-1-Proteinexposition führt6,7,8. Dopaminerge Veränderungen wurden zuvor bei der HIV-1 Tg-Ratte nachgewiesen, und HIV-1 selbst ist eine entzündliche Erkrankung, so dass die Antikörperwahl für das experimentelle Design relevant war9,10,11,12. CTB ist ein Tracer, der über Gangliosidbindung an Neuronen bindet und verwendet werden kann, um affelinete Projektionen im Gehirn zu verfolgen. CTB wurde zuvor verwendet, um Projektionen vom Nucleus accumbens bis zum Substantia nigra-Bereich zu untersuchen, zwei Bereichen des Gehirns, die stark an dopaminergen Signalwegen beteiligt sind13,14,15.
In diesem Protokoll wird TH als Marker für die Dopaminproduktion dienen, und Iba1 wird aktivierte Mikroglia markieren. Der verwendete TH-Antikörper kennzeichnet selektiv ein einzelnes Band bei etwa 62 kDa, das der Tyrosinhydroxylase entspricht. Der Iba1-Antikörper entspricht der Iba1-Carboxy-terminalen Sequenz. Beide Antikörper wurden bei Kaninchen aufgezogen und waren polyklonal. CTB wird zur retrograden Rückverfolgung von Neuronen vom Nucleus accumbens-Bereich bis zum Substantia nigra-Bereich verwendet. Das aktuelle Protokoll bietet auch eine Richtlinie für die Anpassung des ursprünglichen iDISCO-Protokolls auf zwei verschiedene Arten: 1) Gesamtreduktion der Hintergrundfärbung durch Änderung der Serumreagenzien in den Blockierungsschritten und 2) Skalierung der Inkubationszeit, um für größere Gewebeproben geeignet zu sein. Insgesamt liefert das vorliegende Protokoll weiterhin Beweise dafür, dass hydrophobe Clearing-Techniken im Gehirngewebe der Ratte durchführbar sind, keine erkennbaren schädlichen Wechselwirkungen mit HIV-1-Virusproteinen aufweisen und mit TH-Antikörpern, Iba1-Antikörpern und CTB kompatibel sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tissue Clearing bietet eine Lösung für die Einschränkungen des traditionellen IHC-Protokolls. Eine transparente Probe minimiert die Streuung und Absorption von Licht, was auf zellulärer Ebene einen optischen Zugang zu intaktem Gewebebietet 18,19. Gewebereinigungstechniken machen ein Gewebe durch Entgiftung, Entfärbung und Entkalkung mit der Verabreichung von Lösungsmitteln transparent. Sobald der Brechungsindex der Gewebeprobe mit dem Brechungsindex des gew…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse finanziert: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 & durch T32 Training Grant 5T32GM081740
Materials
| Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | C34775 | |
| DBE | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
| DCM | Sigma-Aldrich | 270997-100mL | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-1L | |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-500 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647 | Invitrogen | A32733 | |
| Goat serum | Sigma Life Science | G9023-10mL | |
| Heparin | Acros Organics | 41121-0010 | |
| Iba1 primary antibody | FUJIFILM Wako | 019-19741 | |
| Kwik-sil epoxy | VWR | 70730-062 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1l-R | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP2944-100 | |
| Perfusion machine | VWR | 70730-062 | mini pump variable flow |
| PFA | Sigma-Aldrich | 158127-3KG | |
| TH primary antibody | Millipore Sigma | AB152 | |
| TritonX-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Tween-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
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