Une méthode de nettoyage des tissus hydrophobes pour le tissu cérébral de rat

Summary

Nous présentons ici une méthode de nettoyage des tissus hydrophobes qui permet de visualiser les molécules cibles dans le cadre de structures cérébrales intactes. Cette technique a maintenant été validée pour les rats transgéniques F344/N et le VIH-1 des deux sexes.

Abstract

Les méthodes de nettoyage des tissus hydrophobes sont des procédures facilement ajustables, rapides et peu coûteuses qui permettent l’étude d’une molécule d’intérêt dans des échantillons de tissus non inaltérables. Les procédures traditionnelles d’immunomarquage nécessitent de couper l’échantillon en sections minces, ce qui limite la capacité d’étiqueter et d’examiner les structures intactes. Cependant, si le tissu cérébral peut rester intact pendant le traitement, les structures et les circuits peuvent rester intacts pour l’analyse. Les méthodes de nettoyage précédemment établies prennent beaucoup de temps pour nettoyer complètement le tissu, et les produits chimiques agressifs peuvent souvent endommager les anticorps sensibles. La méthode iDISCO élimine rapidement et complètement les tissus, est compatible avec de nombreux anticorps et ne nécessite aucun équipement de laboratoire spécial. Cette technique a été initialement validée pour l’utilisation dans les tissus de souris, mais le protocole actuel adapte cette méthode à l’imagerie des hémisphères de contrôle et des cerveaux de rats transgéniques. En plus de cela, le protocole actuel apporte également plusieurs ajustements au protocole préexistant pour fournir des images plus claires avec moins de taches d’arrière-plan. Les anticorps dirigés contre l’Iba-1 et la tyrosine hydroxylase ont été validés chez le rat transgénique VIH-1 et chez les rats témoins F344/N en utilisant la méthode actuelle de nettoyage des tissus hydrophobes. Le cerveau est un réseau entrelacé, où les structures travaillent ensemble plus souvent que séparément les unes des autres. L’analyse du cerveau en tant que système entier par opposition à une combinaison de pièces individuelles est le plus grand avantage de cette méthode d’éclaircissement du cerveau entier.

Introduction

Plusieurs techniques de nettoyage des tissus ont été validées pour une utilisation dans le cerveau : hydrogel, hydrophile et hydrophobe. Ces techniques visent à rendre un tissu transparent par délipidation, décoloration et décalcification via l’administration de solvants. Une fois que l’indice de réfraction de l’échantillon de tissu correspond à l’indice de réfraction du milieu d’imagerie choisi, une image claire de l’échantillon peut être obtenue. Les techniques à base d’hydrogel, telles que CLARITY, sécurisent les biomolécules dans les tissus en les reliant à des hydrogels à base d’acryl, ce qui empêche les dommages structurels et la perte de protéines¹. Cependant, les techniques d’hydrogel utilisent des produits chimiques agressifs qui ont le potentiel d’endommager des tissus plus fragiles, et des échantillons de tissus plus denses peuvent ne pas être compatibles avec le protocole d’hydrogel. Certaines techniques d’hydrogel peuvent nécessiter un équipement coûteux ou entraîner une expansion des tissus. Les techniques hydrophiles, comme CUBIC, préservent la structure 3D par la formation de liaisons hydrogène dans le tissu². L’expansion tissulaire peut également se produire dans certains protocoles hydrophiles. La capacité de nettoyage des techniques hydrophiles ne correspond souvent pas à la capacité des techniques hydrophobes, ce qui est important pour les tissus plus denses et plus épais³.

Les techniques hydrophobes sont généralement rapides, ne nécessitent pas d’équipement spécial et produisent un échantillon facile à manipuler et à stocker. iDISCO est une technique hydrophobe qui élimine le retrait qui peut se produire dans d’autres protocoles hydrophobes. À l’origine, la technique de nettoyage des tissus iDISCO a été décrite par Renier et al.⁴ pour les embryons et les organes adultes denses de souris. Cette technique élimine l’eau du tissu lors de l’étape initiale de déshydratation, réduisant ainsi la diffusion de la lumière. Le tissu est perméabilisé pendant le prétraitement pour permettre une pénétration profonde des anticorps. Les colorants Alexa Fluor dans le spectre rouge lointain sont utilisés pour l’immunomarquage afin d’éviter l’autofluorescence du tissu à des longueurs d’onde inférieures⁵. Les tissus qui ont subi des protocoles de nettoyage hydrophobes peuvent être manipulés facilement et peuvent être imagés plusieurs fois en raison de la longévité des colorants Alexa Fluor. S’ils sont correctement stockés, les tissus peuvent fournir des images pendant des mois à un an après le traitement initial.

Dans le présent protocole, l’anticorps tyrosine hydroxylase (TH), l’anticorps Iba1 et la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB) ont été utilisés sur les cerveaux de rats témoins masculins et féminins et transgéniques (Tg) du VIH-1. Le rat HIV-1 Tg possède sept des neuf gènes qui composent le génome viral du VIH-1, ce qui conduit à un modèle non infectieux d’exposition à long terme à la protéine VIH-1^6,7,8. Des altérations dopaminergiques ont déjà été démontrées chez le rat Tg VIH-1, et le VIH-1 lui-même est une maladie inflammatoire, de sorte que le choix de l’anticorps était pertinent pour le plan expérimental^9,10,11,12. CTB est un traceur qui se fixe aux neurones via la liaison ganglioside et peut être utilisé pour tracer les projections afférentes dans le cerveau. CTB a déjà été utilisé pour étudier les projections du noyau accumbens à la zone substantia nigra, deux zones du cerveau fortement impliquées dans les voies dopaminergiques^13,14,15.

Dans ce protocole, TH servira de marqueur pour la production de dopamine, et Iba1 marquera la microglie activée. L’anticorps TH utilisé marque sélectivement une seule bande à environ 62 kDa qui correspond à la tyrosine hydroxylase. L’anticorps Iba1 correspond à la séquence carboxy-terminale Iba1. Les deux anticorps ont été élevés chez le lapin et étaient polyclonaux. Le CTB sera utilisé pour le traçage rétrograde des neurones de la zone du noyau accumbens à la zone de la substantia nigra. Le protocole actuel offre également une ligne directrice pour l’ajustement du protocole iDISCO original de deux manières distinctes: 1) réduction globale de la coloration de fond en modifiant les réactifs sériques dans les étapes de blocage, et 2) mise à l’échelle du temps d’incubation pour convenir à des échantillons de tissus plus importants. Dans l’ensemble, le présent protocole fournit des preuves continues que les techniques de clairage hydrophobe sont réalisables dans les tissus cérébraux du rat, n’ont aucune interaction néfaste perceptible avec les protéines virales du VIH-1 et sont compatibles avec les anticorps TH, les anticorps Iba1 et le CTB.

Protocol

Tous les protocoles animaux ont été examinés et approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Caroline du Sud. 1. Préparation de la solution d’élevage Solution 1 (1 L) : À 900 mL de H2O désionisé, ajouter 100 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 2 mL de Triton X-100. Solution 2 (1 L) : À 900 mL de H2O désionisé, ajouter 100 mL de 10x PBS, 2mL de Tween-20 et 1 mL de solution mère …

Representative Results

L’élimination complète de grandes sections de tissu cérébral de rat F344/N et VIH-1 a été réalisée à l’aide de ce protocole modifié de nettoyage des tissus hydrophobes. La figure 1 montre une image confocale typique de TH dans la région de substantia nigra. La figure 1A représente une coloration dense et positive. Les zones denses comme celles-ci peuvent être analysées en se concentrant à travers le plan « Z » pour confirmer une coloration…

Discussion

L’élimination des tissus offre une solution aux limites du protocole IHC traditionnel. Un échantillon transparent minimise la diffusion et l’absorption de la lumière, ce qui fournit un accès optique au niveau cellulaire aux tissus intacts^18,19. Les techniques de nettoyage des tissus transforment un tissu transparent par délipidation, décoloration et décalcification avec l’administration de solvants. Une fois que l’indice de réfraction de l’écha…

Materials

Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488	Invitrogen	C34775
DBE	Sigma-Aldrich	108014-1KG
DCM	Sigma-Aldrich	270997-100mL
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-1L
Glycine	Fisher Chemical	G46-500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647	Invitrogen	A32733
Goat serum	Sigma Life Science	G9023-10mL
Heparin	Acros Organics	41121-0010
Iba1 primary antibody	FUJIFILM Wako	019-19741
Kwik-sil epoxy	VWR	70730-062
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1l-R
PBS	Fisher Bioreagents	BP2944-100
Perfusion machine	VWR	70730-062	mini pump variable flow
PFA	Sigma-Aldrich	158127-3KG
TH primary antibody	Millipore Sigma	AB152
TritonX-100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Tween-20	Fisher Bioreagents	BP337-500